华理分子生物学实验

曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析接入载体为pET-28a，外源基因为AFL-1，PCR产物直接酶切（NdeI/BamHI）后纯化连接pET28a 外源基因信息：/gene/?term=3504452AFL1-1（Gene ID=3504452）序列信息统计如下：1 atggcttctc caattctgcg atcaccgatt acttcggacc tcgccaacgt aacacccgat61 ttggtggatg ttagcactcc cgaaaaattg aaatcctacc gcgaatcact tgaaccaatc121 ttcactttgg agaatatcat ccgagggaaa gagaacatca tctcctacga ggaactggac181 atcccaggcc ccgcaggacc gatgcgggcc accatcttcc gccccaagca ccaaacccac241 cctatcgatg aaatccctgg tatcctacac atccacggcg ggggcctcgc cacgggaaac301 cgcttcctgg gcttcaccat gctcgactgg gtcgagtccc tcggtgccgt ctgcctgacg361 gccgagtacc gtctcgcccc ggaacatcac cagcccgccc agctggaaga cagctacgcc421 gcgctgcagt ggatgagcga ccacgccgcc gagctgggct tcaacccgcg caagctggtt481 gtctgcggta gctcggcggg gggcaatctc acggcggggg tcaccttact cgcgcgggac541 cgctcgggcc cgcaaatccg cggccaggtg ttgatctatc cgtgggttga cgatggcatg601 gactacgtgt ccatgcggca gtatgcggat attgcgcctg tgagggacgt ggacgccgcc661 gtgttggcta attatgcgtt tggcgagagg cgcgagcacg cggatatgta tactgtgccg721 atgcgcgcga cgaatttcgc gggcttgccc ccgacgttta tcgatgtggg tgaggcggat781 gtgtttcgtg atcaggatat cgcgtacgcg tcggctttgt ggaaggatgg tgtctcgact841 gagttgcatc tgtggccggg cagttggcat gggtttgatg tctttgttcc tgatgctccc901 attagtcggc gggcgagggc tgctcggttg gaatggcttc ggaagttgtt aagtgtgcct外源基因PCR扩增引物序列：P1: 5’GCGCGGCAGC CAT ATG GCT TCT CCA ATT CTG CGA 3’P2: 5’GCTCGAATTC GGA TCC AGG CAC ACT TAA CAA CTT CCG AAG 3’N端保留了标签，用于亲和层析实验流程安排第一天外源基因的制备涉及实验：PCR、酶切、电泳、回收掌握实验原理：PCR及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收实验顺序：PCR扩增-->电泳-->纯化-->酶切-->电泳-->割胶及回收-->载体接种进度限制点：PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行上交样品：外源基因回收样品，标记好组号外源基因的PCR制备体系1# 2#总体积50μl 50μlddH2O 35μl 34μl10×buffer 5μl 5μldNTP（2.5mM）4μl 4μlP1（5pmol/μl）2μl 2μlP2（5pmol/μl）2μl 2μl模板DNA 1μl 2μlTaq酶（5U/μl）0.25μl 0.5μlPCR反应条件：退火温度61度30s，延伸时间1min。

预变性：95度，5min，变性95度，30s，退火61度，30s，延伸72度，1min，30循环。

延伸72度，10min，4度保存。

或取出实验，或取出后-20度保存。

PCR回收样品的酶切体系总体积ddH2O PCR回收产物Buffer NdeI/BamHI 40μl 15μl 20μl 4μl 0.6+0.6μl 酶切反应条件：37度水浴保温30 min。

PCR产物纯化：产品说明书DNA片段回收：胶回收试剂盒说明书思考问题：1. PCR中的退火温度和延伸时间如何确定？产物浓度不高的原因？2. PCR实验中如果出现无产物，该如何分析原因？3. PCR扩增产物如果保证其准确性？如果出现扩增基因点突变时，有何解决方法？4. 电泳中针对300 bp和5.6 kb的片段，胶浓度如何选择？5. 胶回收过程中出现无产物带时，如何选择原因？第二天载体质粒的制备涉及实验：质粒抽提、酶切、电泳、回收、连接掌握实验原理：质粒抽提、连接及体系确定实验顺序：抽提质粒-->电泳-->酶切-->电泳-->割胶回收-->电泳-->连接-->感受态接种进度限制点：均为各组独立实验，无限制点上交样品：载体质粒（P）、载体酶切片段（F）、连接样品（L），标记组号质粒提取：产品说明书载体质粒双酶切Total 40 μlddH2O 34-X μl10×buffer 4 μl质粒DNA X μlNdeI/BamHI 1+1 μl酶切反应条件：37度水浴保温30 min。

正常情况下，全做酶切。

（因回收后条带较淡）连接体系∑10×Buffer 载体片段外源片段T4 DNA连接酶15 μl 1.5 μl X μl Y μl 0.5 μl连接反应条件：4度水浴保温过夜。

思考问题：1. 质粒的拷贝数通常有哪些？对于低拷贝质粒的制备该如何进行？2. 未酶切的质粒正常带型是如何分布的？如出现异常现象该如何处理？3. 双酶切如发生酶切不完全时，产物带如何分析？在电泳中如果观察？4. 重组质粒构建中外源和载体的投入量如何确定？针对不同粘性末端的DNA片段连接该注意什么？5. 大体积酶切（如1ml体积，DNA量为毫克级）该如何设计酶切体系和酶切时间？第三天转化与RNA抽提涉及实验：感受态细胞制备、转化、RNA抽提掌握实验原理：细菌细胞感受状态、转化、细菌RNA抽提实验顺序：翻瓶(7:30)-->感受态细胞制备-->RNA抽提-->转化-->RNA样品电泳-->涂板进度限制点：冷冻离心和操净台公用上交样品：涂布平板2块/组，统一放置37度培养箱大肠杆菌感受态细胞的制备1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃下隔夜培养。

2. 挑取单菌落接种于30ml LB液体培养基中，37℃下隔夜培养。

3. 按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30ml LB培养基中。

4. 在37℃的水浴摇床中培养1.5小时，OD600接近0.5。

（以上步骤教师完成）5. 4℃，6 000 rpm 离心10分钟收获菌体。

1.0ml/管，4管/组6. 上述菌体沉淀用100 μl/管的100 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，并合并于一管，4 ℃, 6 000 rpm离心10分钟。

7. 弃上清，将沉淀用100 μl的100 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮。

8. 冰水浴中放置3-5h放可使用。

RNA抽提：产品说明书大肠杆菌的转化1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。

2. 在90 μl感受态细胞悬浮液，加入6 μl DNA连接溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置30分钟。

3. 混匀，42℃水浴中脉冲2分钟，快速转移至冰水浴中，加入900μl LB培养基，37℃摇床培养1~1.5小时。

（42℃热脉冲前混匀菌体）4. 吸取适量已转化的感受态细胞涂布于100μg/ml 卡那霉素的LB平板上。

5. 37℃下倒置培养12~16小时后计数。

思考问题：1. 大肠杆菌转化除了感受态细胞转化方法外，还有哪些方法？2. 细菌RNA的半衰期特点？如何判断RNA的抽提质量？3. 抽提RNA过程中为何要带手套和口罩？常规DNA电泳可以分析RNA抽提质量否？4. 转化子筛选原理？一般筛选中还有哪些方法？5. 转化完成最后筛选平板上几乎没有转化子，转化失败可能的原因有哪些？第四天重组子鉴定与转录水平的表达分析涉及实验：转化计数、单菌落接种、菌落PCR、RT-PCR掌握实验原理：转化子与重组子、RT-PCR实验顺序：菌落接种（Eppedorf）-->RT-PCR-->电泳-->菌落PCR-->电泳-->接种进度限制点：PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行上交样品：接种重组子的试管1根/组，统一放置37度摇床培养逆转录体系（电子产品说明书RR037A）∑5×Buffer (含dNTP)Enzyme Mix Oligo dT Random 6mers RNA RNA Free dH2O10 μl 2 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 1 μl 5.5 μl对照∑5×Buffer Enzyme Mix Oligo dT Random 6mers RNA RNA Free dH2O10 μl 2 μl 0 μl 0.5 μl 0.5 μl 1 μl 6 μl逆转录反应条件：37℃15min85℃5 secPCR体系：逆转录组对照组总体积20μl 20μlddH2O 7μl 7μl2×MIX 10μl 10μlP1（5pmol/μl）1μl 1μlP2（5pmol/μl）1μl 1μl模板DNA（逆转录溶液）1μl 1μl菌落PCR总体积25μlddH2O 10μl2×MIX 12.5μlP1（5pmol/μl）1μlP2（5pmol/μl）1μl模板DNA（菌液）0.5μl每组完成4个菌落的PCR鉴定，其中BL21（DE3）和DH5a各两个；PCR反应条件：退火温度61度30s，延伸时间1min。

预变性：95度，5min，变性95度，30s，退火61度，30s，延伸72度，1min，30循环。

延伸72度，10min，电泳鉴定。

思考问题：1. 逆转录过程中需要注意RNA酶污染情况否？为什么？2. RT-PCR是定性分析外源基因表达情况？如果要进行定量分析外源基因表达情况，如何设定内参？3. 菌落PCR的模板DNA来源何处？为何能直接以菌液模板进行PCR？血液样品可否直接PCR？4. PCR预混液主要包括哪些组份？如进行批量转化子的菌落PCR鉴定，如何实验可以大大节约时间？如果没有购买预混液，可否自行配制？如果进行？第五天重组菌的蛋白表达涉及实验：重组菌表达、SDS-PAGE灌胶、蛋白电泳掌握实验原理：诱导、SDS-PAGE电泳实验顺序：翻瓶-->制分离胶-->诱导-->制浓缩胶-->菌体样品处理-->点样电泳进度限制点：菌体培养摇床公用上交样品：无SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配制组分分离胶（μl）浓缩胶（μl）双蒸水1650 270030％丙烯酰胺2000 670（甲叉双丙烯酰胺）分离胶缓冲液（PH8.8）1250 —浓缩胶缓冲液（PH6.8）—50010％SDS 50 4010％过硫酸铵50 40TEMED 2.5 2.5总体积5000 4000菌体电泳样的制备将菌体均匀悬浮，测OD600，若>1，则稀释，离心，弃上清，按照1OD/1ml沉淀中加入100µl 1* loading buffer (50水+50µl 2*loading buffer)，悬浮，沸水浴5min，离心后，3µl 上样。