药典三部版通则细菌内毒素检查法
中国药典细菌内毒素检测方法
检测细菌内毒素的方法
1、热原检查
通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。
2、凝胶法
通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
3、光度法
浊度法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
显色基质法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
细菌内毒素检查法
Et
0.125Eu／ml
0.5λ ≤ Es ≤ 2λ 且 Et =0.5Es,干扰成立
十、干扰试验结果分析
反应结果4：增强 E0.5 E0. 25 E0.125
++++ ++++ - - - SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125
E0.06 ---SDE0.06
九、供试品的干扰试验
3.在何种情况下需做干扰试验： 新品种建立方法 鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它有可能影响试验 结果的变化。
九、供试品的干扰试验
凝胶法干扰试验溶液的制备
编 号 A B 内毒素浓度/配制内毒 素的溶液 无/检查用水 2λ /检查用水 稀释用液 ----检查用水 稀释倍数 ----1 2 4 8 所含内毒素 的浓度 ----2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 平行管数 2 4 4 4 4
0.5λ ≤ Es ≤ 2λ 且Es=Et,干扰成立
十、干扰试验结果分析
反应结果2： E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 ++++ ++++ ++++ - - - SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 ++++ ++++ - - - - - - - -
十、干扰试验结果分析
按下式计算系列溶液C和溶液B的反应终点浓 度的几何平均值(Es和Et) Es=antilg(∑Xs／4) Et=antilg(∑Xt／4) Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终 点浓度的对数值(lg)。 当0.5λ ≤Es≤2λ 且0.5Es≤Et≤2Es 时，认 为供试品在该浓度下无干扰作用。 USP、EP规定当0.5λ ≤Es≤2λ 且 0.5λ ≤Et≤2λ 时，认为供试品在该浓度下 无干扰作用。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
中国药典版《细菌内毒素检查法》(2020年整理).pptx
表 3 凝胶半定量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素的 溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素的浓 度
A
无/供试品溶液
检查用水
1
—
平行管数 2
2
—
2
4
—
2
8
B
2λ水
检查用水
1
2
4
—
2
2λ
2
2λ
2
1λ
2
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
无/检查用水
—
—
—
2
注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数
λc=1g-1(∑X/4)
1
学海无 涯
式中 X 为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc 在 0.5λ-2λ(包括 0.5λ和 2λ)时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验 按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D，使用的供试品溶液应为未检 验 出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（ MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏 度复 核试验项下操作。 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶 液 C 和 B 的反应终点浓度的几何平均值（Es 和 Et）。
扰 的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作
。
编号 A
内毒素浓度/配制内毒素的溶液 表 2 凝胶限量试验溶液的制备
无/供试品溶液
平行管数 2
2005年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》
2005年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指含量小于0.015EU/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0—8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg²h)表示，注射剂K=5E U/(kg²h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg²h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg²h)；M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg²h)、mg (kg²h)或U/ (kg²h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则
《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则包括以下几个方面：
1.细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2.在应用细菌内毒素检查法时，应考虑到各种药品的特性和使用方法，以确保结果的准确性和可靠性。
3.在进行细菌内毒素检查时，应严格遵守操作规程，确保实验过程的标准化和规范化。
4.对于细菌内毒素的检测结果，应结合其他实验室检查结果和临床表现进行综合分析，以得出正确的诊断结论。
以上信息仅供参考，建议查阅《中国药典》获取更全面准确的信息。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
细菌内毒素检测
1
概述
前言
细菌内毒素
一、前言
热源检查易受试验动物个体差异、方法灵敏度、 药物本身性质的影响，受到一定限制，与家兔 热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度 低，实验成本小等特点，还可以通过对原料、 活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的 细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明 显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能 污染的痕量内毒素，为区分干扰作用与内毒素 污染提供了极为重要的技术手段。
干扰无法去除 选择其他方法
2006年6月 山东省药品检验所 26
1 内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素 限值要求？样品的内毒素含量是多少？与前 一批的结果比较相差多少？与内毒素限值含 量相差多少？ 这些问题不但关注用药安全，同时也考虑了 生产环境的内毒素含量变化。 因此，一个完善的细菌内毒素检查法的建立， 除了要满足法规相关的强制性要求，保证临 床用药人群的安全外，还应该最大限度的提 供有关内毒素含量的信息，为药品生产过程 的质量控制提供警戒信息。
2006年6月
山东省药品检验所
22
三、方法学验证注意事项 一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法 验证实验一般应注意：首先要了解产品的 溶解度，按照适当的临床用量确定合适的 内毒素限值，并确证产品对方法是否存在 干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈 的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法 不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。
2006年6月
山东省药品检验所
9
3 鲎试剂凝胶反应的特征
⑴随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不 断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会 增加。 ⑵内毒素的浓度决定了光密度增加的速 率。 ⑶凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的 平台期、快速增长期和后期的平台期）。 这些特性构成了各种检测方法的理论基 础。
各国药典细菌内毒素检查法
JP本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus 或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以凝胶法测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
内毒素储备标准溶液的制备以BET检查用水溶解内毒素10000对照标准品或内毒素100对照标准品，制取细菌内毒素试验（BET）的内毒素储备标准溶液。
内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
1EU相当于1个内毒素国际单位（1U）。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用水稀释，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释药品来制备供试品溶液。
药用容器内盛放的供试品溶液的制备方法见其他具体规程。
如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂的使用pH范围内。
一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。
试液或调节pH值用溶液应用BET检查用水配制，在去除内毒素的容器中贮存。
确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。
细菌内毒素检查法
二、2010年版《中国药典》细菌内毒 素检查法增修订情况
2010版与2005版区别
修订背景
注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查
法指导原则
2010版与2005版区别
2010版 1、细菌内毒素检查用 水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝 胶法）或0.005EU/ml （用于光度测定法）且 对内毒素试验无干扰作 用的灭菌注射用水 2005年版 凝胶法细菌内毒素检查 用水系指内毒素含量小 于0.015EU/ml的灭菌 注射用水。光度测定法 用的细菌内毒素检查用 水，其内毒素的含量应 小于0.005EU/ml
种类以及分布： – 美洲鲎：北美洲东岸海域 – 中国鲎：中国东南沿海 – 南方鲎：泰国和马来群岛海域 – 圆尾鲎：东南亚西部海域
鲎试验的发现
1956年Johns Hophins 大学动物学家 Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品 能使鲎的血细胞凝聚。
1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引 起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞 溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。
实验基本流程图
供试品 限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验
供试品干扰实验
结果判断
2. 试剂、仪器设备等
细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。
国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
2005年版
内毒素限值按L=K/M计算， M为人用每公斤体重每小 时的最大供试品剂量，以 ml/（kg²h）、mg/ （kg²h）或U/（kg²h） 表示，人均体重按 60kg 计算，注射时间若不足1 小时，按1小时计算。
中国药典三部标准(2005)
中国药典三部标准(2005年版)正文101种A群脑膜炎球菌多糖疫苗拼音名：A Qun Naomoyanqiujun Duotang Yimiao英文名：Group A MeningococcaI Polysaccharide Vaccine书页号：2005年版三部-34本品系用A群脑膜炎奈瑟菌培养液，经提取获得的荚膜多糖抗原，纯化后加入适宜稳定剂后冻干制成。
用于预防A群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1 菌种名称及来源生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟菌CMCC 29201(A4)菌株。
2.1.2 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 种子批的传代主种子批启开后传代次数不得超过5代，工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。
2.1.4 种子批菌种的检定2.1.4.1 培养特性及染色镜检菌种接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25%不生长。
于35～37% 二氧化碳的环境中培养16～20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。
染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2.1.4.2 生化反应发酵葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖、甘露醇、果糖及蔗糖(附录ⅥV)。
2.1.4.3 血清凝集试验取经35～37℃培养1 6～20小时的菌苔，混悬于含0.5%甲醛的生理氯化钠溶液中，或56℃加热30分钟杀菌以后，使每1ml含菌1.o×10〈9〉～2.o×10〈9〉，与同群参考血清做定量凝集反应，置35～3℃过夜，次日再置室温2小时观察结果，以肉眼可见清晰凝集现象(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价，必须达到血清原效价之半。
2.1.5 种子批的保存原始种子批和主种子批应冻干保存于2～8℃。
细菌内毒素检查法
灵敏度有：0.5EU/ml; 0.25EU/ml; 0.125EU/ml ;0.06EU/ml ,0.03EU/ml 灵敏度是能使鲎试剂产生坚实凝胶的标准内毒素 的最低浓度。
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鲎（hòu）亦称马蹄蟹
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虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛 以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。
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4.1 试验材料及器具：
内毒素工作标准品: 由大肠埃希菌提取精制而成。 我们一般使用的是60EU/支或80EU/支。
细菌内毒素检查用水: 凝胶法：内毒素含量<0.015EU/ml的灭菌注射用水 光度法：内毒素含量<0.005EU/ml的灭菌注射用水
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4.1 试验材料及器具：
漩涡混匀器
供试品 确定样品的内毒素是否在规定范围内 D 溶液 阳性：供试品内毒素含量≥灵敏度X稀释倍数
阴性：供试品内毒素含量<灵敏度X稀释倍数
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4.7 结果判断
结果判断 符合规定
溶液A 阳性 对照
++
溶液B 阴性 对照
--
溶液C 供试品 阳性对照
++
溶液D 供试品
--
不符合规定 + + - - + + + +
0.1mlBET水+0.1mlE2λ
B
阴性对照
0.1mlBET水+0.1mlBET水
C 供试品阳性对照 0.1mlBET水+0.1mlSMVDE2λ
D 供试品溶液
0.1mlBET水+0.1SMVD
平行管数
2 2 2 2
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法(译自英国药典版，等同欧洲药典版。
见原文之附录BP2004EP5XIV A方法)2.6.14.本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法限度试验方法的制定者希望弄清楚，如在--.生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。
细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的(,,,试验)。
将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。
反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、和温度;反应要求有一定量pH 的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。
采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。
下面五种方法将在后面文章中介绍;方法:凝胶法;限度试验A方法:半定量凝胶法B方法:动力学浑浊法C方法:动力学发色肽方法D方法:发色肽终点法E当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法。
次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在A 专门文献中特别提到。
很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。
试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。
检测前的准备工作中，必须证实如下内容:1——所以的设备器皿不吸附内毒素。
——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的(定量法)。
——干扰素的排除;如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。
除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。
在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。
本试验包括如下试剂和标准溶液制备:标准细菌内毒素BRP;与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。
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药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
注射时间若不足1小时，按1小时计算。
供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：MVD=cL/λ式中 L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。
如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml标示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支。
其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程中应避免收到振动，造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=ant ilg（∑X/n）式中 X为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数。
当λc在0.5～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
列；D为阴性对照。
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
当系列浓度B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法⑴ 凝胶限度试验按表2制备溶液A、B、C和D。
使用稀释倍数不超过MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。
若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
复试时溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。
若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A出现不符合规定时，需将供试品稀释至MVD重新实验，再对结果进行判断。
⑵ 凝胶半定量试验本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
按表3制备溶液A、B、C和D。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5～2λ，试验有效。
系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度。
如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度c。
若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。
每一系=antilg列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式cE（∑c/2）]。
若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。
若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。
当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。
B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。
C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
方法2 光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。
终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。
终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素制成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10倍），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。
每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。