代谢调控理论在微生物发酵中的应用

代谢调控理论在微生物发酵中的应用

参考文献

贾红华，韦萍，何冰芳.L苯丙氨酸生产的代谢工程研究.生物加工过程.2004,2(2)：8-12

目的

使得更加理性的改造菌株成为可能，促进发酵法的广泛应用

方法

目前至少已发现 7种微生物的苯丙氨酸合成途径，且均非常相似。

由于野生菌不会直接大量产生L-苯丙氨酸，高效的L-苯丙氨酸生产菌株多采用诱变和基因工程手段相结合来改变野生菌的芳香族氨基酸生物合成的相关代谢流量而获得。研究人员对L-苯丙氨酸生物合成途径中相关基因及其酶进行调控，并对中央代谢途径进行一定的改造，在芳香族氨基酸生物合成支路中也进行特定的修饰。

相关基因及其酶进行调控

PEP和E4P合成DAHP的反应由3个DAHP合成酶同工酶所催化。分别受L-色氨酸(由aroH表达)、L-苯丙氨酸(由aroG表达)和L-酪氨酸(由aroF)反馈抑制。作为关键反应之一的分支酸转化为预苯酸的反应依赖于两个不同的分支酸变位酶(分别由phoA，tyrA表达)，并分别受L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反馈抑制。而莽草酸脱氢酶则受其产物莽草酸抑制。

中央代谢途径改造

中央代谢途径是控制中间产物的代谢流量、产物的形成速率及产率的关键步骤。为高效生产目的产品，必须对中央代谢途径的相关步骤进行调节控制。

芳香族氨基酸生物合成途径的共同前体PEP和E4P均来自中央代谢途径(如图2所示)。糖酵解途径会产生PEP，而E4P则由磷酸戊糖途径供应。通过对E.coli 的中央代谢途径的计量分析显示，当该菌生长在以葡萄糖作为唯一碳源的限制性培养基上时，大约有30%的G6P会进入磷酸戊糖途径，但仅有3%的PEP用于芳香族氨基酸的生物合成。

研究表明：仅有当量PEP供应时，L-苯丙氨酸的理论产率为30%，当PEP 的供应量加倍时，其理论产率将增加到56%。为改善芳香族氨基酸的生产，研究人员采用分子生物学手段对该两个生物合成途径进行基因构建及改造，且取得了满意的成绩。

图1 L-苯丙氨酸的生物合成途径及其相关调控

在E.coli中，L-苯丙氨酸的一般生物合成途径如图1所示：由4-磷酸赤藓糖(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)缩合形成2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)开始，并把这七碳中间代谢物转化为莽草酸(SHIK)，然后再转化为分支酸(CHA)，由分支酸合成苯丙酮酸(PPY)，最后苯丙酮酸经转氨作用生成L-苯丙氨酸。

图2 E.coli的中央代谢系统

中央代谢途径是控制中间产物的代谢流量、产物的形成速率及产率的关键步骤。为高效生产目的产品，必须对中央代谢途径的相关步骤进行调节控制。

结果分析

增加PEP的供应量

PEP是涉及几个代谢过程的关键中间体。通过构建一PEP羧化酶阴性E.coli 突变株，切断PEP到草酰乙酸的代谢通路，使L-苯丙氨酸的产量提高6倍。如果还同时高水平表达PEP合成酶还可增加芳香族氨基酸合成途径中的碳流量，提高PEP的供应量，从而超量产生DAHP，增加L-苯丙氨酸及其他多种L-型氨基酸的产量。

增加E4P的供应量

转酮醇酶和转醛醇酶是磷酸戊糖途径非氧化阶段的两个关键酶。E4P是由磷酸戊糖之间经转酮醇酶和转醛醇酶催化基团转移产生。超量表达转酮醇酶基因(tktA)，可明显提高E.coli中的转酮醇酶活性和E4P的供应量，同时增加DAHP

的产量。通过大量产生一抗反馈抑制DAHP合成酶和转酮醇酶导致进入芳香族氨基酸生物合成途径的碳流量增加了两倍。采取扩增E.coli中aroG和tktA基因，并使两个丙酮酸激酶同工酶失活，可明显增加DAHP的产量。如果同时表达tktA 和aroF基因，则会使E.coli的DAHP的分泌量增加40倍。

结论

在L-苯丙氨酸的发酵生产中，对其错综复杂的代谢途径的调控已经取得了很大的成就。随着。随着MS和NMS等分析手段与同位素示踪技术的高度发展与相互结合，将为解明细胞中的代谢网络和调控机制提供强有力的技术支持。

随着大量微生物的基因组全序列的逐渐被测定出来，很多微生物代谢网络的特性和功能，尤其是调控机理的逐步解析，在今后的研究中很有希望在更大的程度上应用代谢工程的成果，例如：将两种代谢途径进行协同调控，该手段将开辟更低成本的L-苯丙氨酸以及其他芳香族氨基酸的大规模生产新的路线。