蛋白质的不稳定性与对策PPT讲稿
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蛋白质的不稳定性及其对策
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），
磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，
使用螯合剂
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速；
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
Β-消除反应 转肽作用 外消旋作用 二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀
表面吸附
可能的解决方案
控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度 控制PH、缓冲液 硫醇的消除（如半胱氨酸）
防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长
蛋白质的不稳定性及其对策
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ）， 磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变 影响着蛋白质可溶性和稳定性。 • 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可 能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。 • 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离 子强度。 • 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液 冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速； • 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸 • 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 3.巯基与二硫键 • 在蛋白质的三级结构中，二者起主导作用， 当二硫键交换并导致三维结构发生变化时， 生物活性可能丧失 • 原因：亲核、亲电试剂导致的可逆破坏； • 高温、极端的PH • 二硫键的交换
生物分离工程2(生物分离中蛋白质的不稳定性及其对策)
四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法
㈠ 添加蛋白质稳定剂 添加蛋白质稳定剂 ㈡ 优化操作条件 优化操作条件 ㈢ 减少纯化步骤 减少纯化步骤 ㈣ 进行纯化的过程集成 进行纯化的过程集成
㈠添加蛋白质稳定剂
1. 2. 3. 4. 5. 6.
添加共溶剂 添加共溶剂 添加抗氧化剂和还原剂 添加抗氧化剂和还原剂底物 抗氧化剂和还原剂底物 添加底物、 添加底物、辅酶和辅基 底物 添加金属离子 添加金属离子 添加蛋白酶抑制剂 添加蛋白酶抑制剂 添加蛋白质、 添加蛋白质、磷脂和脂肪酸 蛋白质
1、添加共溶剂
①优先排阻作用的含义 优先排阻作用的 常用的共溶剂②常用的共溶剂-糖类 ③常用的共溶剂-甘油和醇 常用的共溶剂-
①优先排阻作用的含义 优先排阻作用的含义
共溶剂的加入可以改变溶液的热力学性质, 共溶剂的加入可以改变溶液的热力学性质,在 蛋白质表面完全水化和共溶剂完全结合之间建立 了一种平衡,使得天然蛋白质的稳定性增强, 了一种平衡,使得天然蛋白质的稳定性增强,理论 上称为优先排阻作用 上称为优先排阻作用。 优先排阻作用。 常常使用(1～4)mol/L高浓度共溶剂来稳定蛋 常常使用(1～4)mol/L高浓度共溶剂来稳定蛋 白质和细胞器。
4、添加金属离子 添加金属离子
作为酶分子的一部分, 作为酶分子的一部分, 作为酶分子的活化剂, 作为酶分子的活化剂, 金属离子对结构的稳定作用 金属离子对结构的稳定作用 金属离子的抑制作用及变性作用 常用的金属螯合剂 常用的金属螯合剂
金属离子对结构的稳定作用
枯草杆菌蛋白酶 灰色链丝菌蛋白酶 胰蛋白酶等。 胰蛋白酶等。
生物分离工程
第 二章 生化分离制备 中 蛋白质的不 稳定性及其 对策
第二章 生化分离制备中 蛋白质的不稳定性及其对策
蛋白质稳定性及相关研究方法
蛋白质稳定性及相关研究方法蛋白质是生命体中最重要的基础分子之一，它们参与了生命的方方面面，扮演着至关重要的角色。
因此，无论从科学角度还是从医学角度，研究蛋白质的结构和功能都是至关重要的。
但是，由于许多蛋白质在自然状态下非常不稳定，很容易发生降解、变性和聚集等问题，限制了研究的深入程度。
因此，蛋白质稳定性及相关研究方法成为了近年来科学家们研究的热门课题。
一、蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性是指蛋白质在存储、转运和使用过程中维持其天然构象和活性的能力。
然而，许多因素都可能影响蛋白质的稳定性，包括温度、PH值、盐浓度、氧化还原状态、界面作用和聚集等。
其中，温度是影响蛋白质稳定性的最主要因素之一。
日常生活中，许多蛋白质只能在温度较低的条件下保持活性，如酶的最适温度通常在20-40℃之间。
但有些蛋白质需要在高温或极度低温的环境下保持活性，如一些古菌和嗜极生物所表达的蛋白质，在高温或极端寒冷环境下具有较高的热稳定性和冷稳定性。
此外，蛋白质在不同的PH值和盐浓度下也可能表现出不同的稳定性。
例如，有些酶在低盐浓度下会出现聚集现象，并导致失活，而在高盐浓度下，聚集现象可能消失而活性得以维持。
类似地，某些蛋白质在不同PH值下可能会发生酸性或碱性变性，影响其稳定性和活性。
二、蛋白质稳定性的研究方法为了研究蛋白质的稳定性，科学家们提出了许多方法。
最常用的方法之一是热力学分析方法。
热力学分析方法包括热重分析、差示扫描量热法和热差分析等，可以通过测定蛋白质在不同条件下的热稳定性和热响应来评价其稳定性。
此外，蛋白质的稳定性也可以通过生物物理学、生物化学和生物学等多种方法进行研究。
例如，通过利用软X射线晶体学技术研究蛋白质的分子结构，可以了解蛋白质的构象变化机制；还可以通过核磁共振技术、分子动力学模拟等方法揭示蛋白质分子间相互作用的变化和不同结构状态下的动力学性质。
最近，一种叫做聚合酶链式反应（PCR）的技术被广泛应用于评估蛋白质的稳定性。
蛋白质不稳定性分解
第二章
蛋白质的不稳定性及对策
刘耀玺
河南科技大学林业职业学院 生物技术教研室
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序 列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称 空间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质 DNA 的核苷酸序列决定的。 肽键（ CO-NH ）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（ -S-S- ）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（一）氢键： 氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的 作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢 键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外， 氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链 肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。 大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主 链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α螺 旋、β折叠），与此同时保持大多数能成氢键的 侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。
Байду номын сангаас
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
蛋白质的不稳定性及对策
刘耀玺
河南科技大学林业职业学院 生物技术教研室
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序 列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称 空间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质 DNA 的核苷酸序列决定的。 肽键（ CO-NH ）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（ -S-S- ）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（一）氢键： 氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的 作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢 键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外， 氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链 肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。 大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主 链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α螺 旋、β折叠），与此同时保持大多数能成氢键的 侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。
Байду номын сангаас
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
蛋白质不稳定性讲课文档
第十六页，共52页。
五、包含体的形成与性质
(一)包含体的形成 目前，关于包含体的形成机理尚不完全清
楚，一般认为包含体的形成是部分折叠的中 间态之间疏水性相互作用的结果。
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀 的性质，或表达产物周围的物理环境（如温 度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
第九页，共52页。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（三）疏水作用：
水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在分子 的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳定蛋白质 的三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并不是疏水基团 之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开 水的需要而被迫接近。当然，当疏水基团接近到等于范德华距离
诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是永久性偶 极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相互作用；
分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力 学竞争的结果。
第十八页，共52页。
五、包含体的形成与性质
U ki I kr
N
ka
A
其中：U为伸展肽链；I为折叠过程的中间态；N为天然活 性态；A为聚集体（包含体），ki、kr、ka分别为中间
体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体生成速率常数。
活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓 度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发生，反应速率 与浓度的高次方成正比，即反应级数≥2。因此，如果新
第二十二页，共52页。
五、包含体的形成与性质
(一)包含体的形成 目前，关于包含体的形成机理尚不完全清
楚，一般认为包含体的形成是部分折叠的中 间态之间疏水性相互作用的结果。
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀 的性质，或表达产物周围的物理环境（如温 度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
第九页，共52页。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（三）疏水作用：
水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在分子 的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳定蛋白质 的三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并不是疏水基团 之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开 水的需要而被迫接近。当然，当疏水基团接近到等于范德华距离
诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是永久性偶 极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相互作用；
分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力 学竞争的结果。
第十八页，共52页。
五、包含体的形成与性质
U ki I kr
N
ka
A
其中：U为伸展肽链；I为折叠过程的中间态；N为天然活 性态；A为聚集体（包含体），ki、kr、ka分别为中间
体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体生成速率常数。
活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓 度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发生，反应速率 与浓度的高次方成正比，即反应级数≥2。因此，如果新
第二十二页，共52页。
第二章 蛋白质不稳定性
叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（二）范德华力（范德华相互作用）： 广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即： 定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永 久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范 德华力； 诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是 永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相 互作用； 分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉 淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如 温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
五、包含体的形成与性质
现代研究表明：在大多数情况下，包含体 的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋 白质的种类和表达系统无关，即包含体的 形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠 途径等内在性质没有必然的联系。换句话 说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在 过量表达的情况下都可能形成包含体。 蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力 学竞争的结果。
分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策
[ 14]
。
在许多情况下 , 天然蛋白质仅受到蛋白酶的缓慢水 解, 而部分变性的解折叠蛋白质则增大了蛋白水解 酶水解的可能性。微生物的污染极有可能给分离纯 化系统带入蛋白酶。蛋白酶除了造成对肽键的破坏
, Asn 脱酰胺形成的五元琥珀酰亚胺中间产物更
68
外, 在高温水溶液条件下 还会造成 Asp 的肽水解、 Gln 和 Asn 侧链的脱氨基、 Cys 侧链的 去除及二硫 键交 换 , 从 而 对 肽 链 再 折 叠 产 生 极 其 严 重 的 影 响
5) Asn 和 Gln 脱酰胺作用
2 如果一级结构没有变化, 三级或四级结构变化也
热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋 白来说, 平均 150 个氨基酸残基中只有一个盐桥处 于内部, 其它都在分子表面。因此 , 参与稳定蛋白质 的可能是处于分子表面的那些离子键 的稳定性
[ 8, 9] [ 10]
5) 不正确的折叠形式或形成错配的二硫键 从动力学上讲 , 蛋白质在提纯过程中活性的丧 失可能是由天然状态 N 经过一系列相对稳定的中 间态 U 1 , U 2 . . . 而最终达到变性状态 D[ 3] : N U1 U2 D 一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性, 是一个可逆过程, 而成为变性态则有的是可逆的 , 有 的是不可逆的。 1 1 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要 的乃至决定性的作用[ 4] 。Yatani 等人证实蛋白质的 稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决 于蛋 白 质 分 子 内 部 疏 水 性 氨 基 酸 的 个 数[ 5] 。 Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶 稳定性高的原因 , 结果表明 [ 6] , 嗜热酶分子内 部疏 水性氨基酸含量高 , 具有更紧密的疏水核。 氢键和离子键对 稳定性也有作 用。 Pace 等人 发现 [ 7] , 氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同 的甚至更 高的稳定作用 [ 8] 。许多研究者证 实[ 9] 嗜 67
。
在许多情况下 , 天然蛋白质仅受到蛋白酶的缓慢水 解, 而部分变性的解折叠蛋白质则增大了蛋白水解 酶水解的可能性。微生物的污染极有可能给分离纯 化系统带入蛋白酶。蛋白酶除了造成对肽键的破坏
, Asn 脱酰胺形成的五元琥珀酰亚胺中间产物更
68
外, 在高温水溶液条件下 还会造成 Asp 的肽水解、 Gln 和 Asn 侧链的脱氨基、 Cys 侧链的 去除及二硫 键交 换 , 从 而 对 肽 链 再 折 叠 产 生 极 其 严 重 的 影 响
5) Asn 和 Gln 脱酰胺作用
2 如果一级结构没有变化, 三级或四级结构变化也
热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋 白来说, 平均 150 个氨基酸残基中只有一个盐桥处 于内部, 其它都在分子表面。因此 , 参与稳定蛋白质 的可能是处于分子表面的那些离子键 的稳定性
[ 8, 9] [ 10]
5) 不正确的折叠形式或形成错配的二硫键 从动力学上讲 , 蛋白质在提纯过程中活性的丧 失可能是由天然状态 N 经过一系列相对稳定的中 间态 U 1 , U 2 . . . 而最终达到变性状态 D[ 3] : N U1 U2 D 一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性, 是一个可逆过程, 而成为变性态则有的是可逆的 , 有 的是不可逆的。 1 1 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要 的乃至决定性的作用[ 4] 。Yatani 等人证实蛋白质的 稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决 于蛋 白 质 分 子 内 部 疏 水 性 氨 基 酸 的 个 数[ 5] 。 Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶 稳定性高的原因 , 结果表明 [ 6] , 嗜热酶分子内 部疏 水性氨基酸含量高 , 具有更紧密的疏水核。 氢键和离子键对 稳定性也有作 用。 Pace 等人 发现 [ 7] , 氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同 的甚至更 高的稳定作用 [ 8] 。许多研究者证 实[ 9] 嗜 67
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力. 蛋白质的特定功能是由其特定的 空间结构决定的,要保持其生物活 理解蛋白质 力,必须保持其空间结构,稳定蛋白 稳定性的概念? 质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分 子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键 ⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用(思考题)
熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的
变性剂浓度 蛋白质自由能; 最大稳定性温度(Ts); 在特定温度下蛋白质功能活性维持 时间.
思考
熔化温度Tm和蛋白质伸展50%
时的变性剂浓度是预测酶稳定性 的最有用参数;
Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的
温度; 变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展 过程中使蛋白质伸展一半时所需要 的变性剂浓度;
思考
三． 极端pH: 活性中心氨基酸必需基团电离. pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原 则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的 聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 四． 氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及 蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、 H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 五． 表面活性剂和去污剂 表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈 的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离 子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈.
疏水性标尺
疏水性氨基酸越多越稳定?
疏水性与蛋白质稳定性的关系小结
疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排 列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降 低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的 疏水性
蛋白质的不稳定性及其对策分解
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长 小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化） Β-消除反应 转肽作用 可能的解决方案 控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导 致低物理稳定性。 • 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• • • •
1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋 白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率 • 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速 率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
《蛋白质不稳定性》课件
蛋白质二级结构与稳定性
总结词
维持蛋白质二级结构的完整性有助于保持其稳定性。
详细描述
为了维持蛋白质的稳定性，需要保持其二级结构的完整性。这可以通过保持适当的氨基酸序列和避免突变来实现 。此外，环境因素如温度、pH和离子强度等也会影响蛋白质的二级结构和稳定性。因此，了解这些因素对蛋白 质稳定性的影响对于维持其功能至关重要。
蛋白质二级结构是指局部主链的折叠 方式，对蛋白质的整体稳定性有重要 影响。
要点二
详细描述
蛋白质的二级结构是指局部主链的折 叠方式，包括α-螺旋、β-折叠、β-转 角和无规卷曲等。这些折叠方式决定 了蛋白质的三级结构，进而影响其整 体稳定性。例如，α-螺旋结构可以增 加蛋白质的稳定性，而β-折叠结构则 可能降低稳定性。
通过X射线晶体学、核磁共振等技术 可以解析蛋白质的三级结构，进一步 了解其稳定性机制。
详细描述
解析蛋白质的三级结构是了解其稳定 性和功能的关键步骤。通过X射线晶 体学、核磁共振等技术可以解析出蛋 白质的三维构象，从而更好地理解其 稳定性和功能机制。这些技术对于研 究蛋白质的结构与功能关系、设计新 药物和开发新型生物材料等方面具有 重要意义。
详细描述
蛋白质的不稳定性可以被用来调控材料表面的生物活性，从而实现特定的生物医学工程应用。例如， 通过控制材料表面的电荷和疏水性等物理化学性质，可以调控蛋白质在材料表面的吸附和构象变化， 进而影响细胞的生长和分化等过程。
05
蛋白质不稳定性研究展望
蛋白质不稳定性研究现状与挑战
总结词
当前蛋白质不稳定性研究的进展和存在的挑战。
03
蛋白质不稳定性检测方法
热稳定性检测
总结词
通过加热蛋白质样品，观察其稳 定性变化。
蛋白质不稳定性与抗体异质的影响因素-txz
•
•
最常见的是异天冬氨酸形式。不仅来源于Asp的直接异构化，还来源于琥 珀酰亚胺的水解。琥珀酰亚胺中间体依赖pH形成，由Asn脱酰胺或Asp脱 水。中性和碱性下，isoAsp和Asp产物大概比例3：1。 CDR区 H102的Asp 异构化活性将至9-21%。L32的Asp降低Fab2相对活性至42%，两条链都异 构化时降至15%。琥珀酰亚胺形成不需要水的参与，因此在冻干状态也会 发生。无论在Tg温度上下，升高保存温度都会增加异构化。 空间效应也强烈影响异构化速率。CDRs内两个Asp-Gly序列，只有一个位 点发现对异构化易感，另一个则不会发生，可能跟氢键有关。
C-端赖氨酸加工
• 最常见的修饰之一 • 重链C端编码有Lys，但是由于碱性羧肽酶的 活性使其部分或完全移除 • 移除后分子量减小128Da，正电基团减1 • 部分移除时，产生分别含0,1,2个C端Lys的重 链，电荷差异使IEF上可区分多条带，或者 离子交换多个峰。HIC或RP也有分离作用。 • 羧肽酶B处理可减少这方面的异质性。
– 出现88kD条带，L46-52 and H99-121 之间。氧化作用的抑制可以延迟这种 交联。 – a nonreducible thioether bond can be formed between C223 of the heavy chain and the C-terminal Cys residue of the light chain in humanized IgG1 antibodies。质谱75kD，PAGE胶是92kD。冻干的固体剂型中也会发生，at 568C for 18 days led to forma-tion of 100-kDa band under reduced conditions by SDS–PAGE
第四章蛋白质的稳定性ppt课件
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7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。
与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。
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2）蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须 在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与 水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶 失活。
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电容器的极板间充满电介质时的电容与极板间为真空时 的电容之比值称为（相对）介电常数。
物料 水 甲醇 煤油 矿物油
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6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
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• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨
酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。
• 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能
导致二硫键的形成和生物活性的丧失。
• 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且
可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。
• 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂
试剂
制剂中的使用浓度/%
抗氧化剂（所以水溶液）
抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠） 0.1-1.0
亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 0.1-0.5 亚硫酸钠）
硫甘油
0.1-0.5
巯基乙酸
0.05-0.2
半胱氨酸盐酸盐
0.1-0.5
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和
赖氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速
率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变
影响着蛋白质可溶性和稳定性。
• 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可
蛋白质药品中添加剂的作用
• 1.抗微生物保藏剂 • 2.可溶性增强剂 • 3.冻干产品填充剂 • 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化）
Β-消除反应 转肽作用 外消旋作用 二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀
蛋白质的不稳定性与对策课件
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长
小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度效应是连续的
依赖性，多数发生在PH6-7
• 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸
氢盐加速胰岛素破坏
防止氧化降解的措施
• 1.低温下制备与储藏 • 2.使用螯合剂消除金属催化反应 • 3.提高离子强度，减少二硫键的形成 • 4.消除过氧化物和金属污染物 • 5.避光 • 6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反
表面吸附
可能的解决方案
控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度 控制PH、缓冲液 硫醇的消除（如半胱氨酸）
防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
化学稳定性
• 1.PH、水解和缓冲液 • 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 • 3.其它化学不稳定性及制剂方法
应
• 7.生产过程中用氮或氩代替氧 • 8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可
能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。
• 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，
使用螯合剂
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下
显著加速；
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），
磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化
• 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度
能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。
• 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离
子强度。
• 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液
冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方 法
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导
致低物理稳定性。
• 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• 1.水解和脱氨反应
• 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺
• 影响因素：极端PH、温度和离子强度
• பைடு நூலகம்明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋
白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率
酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。
• 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能
导致二硫键的形成和生物活性的丧失。
• 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且
可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。
• 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂
试剂
制剂中的使用浓度/%
抗氧化剂（所以水溶液）
抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠） 0.1-1.0
亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 0.1-0.5 亚硫酸钠）
硫甘油
0.1-0.5
巯基乙酸
0.05-0.2
半胱氨酸盐酸盐
0.1-0.5
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和
赖氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速
率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变
影响着蛋白质可溶性和稳定性。
• 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可
蛋白质药品中添加剂的作用
• 1.抗微生物保藏剂 • 2.可溶性增强剂 • 3.冻干产品填充剂 • 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化）
Β-消除反应 转肽作用 外消旋作用 二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀
蛋白质的不稳定性与对策课件
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长
小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度效应是连续的
依赖性，多数发生在PH6-7
• 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸
氢盐加速胰岛素破坏
防止氧化降解的措施
• 1.低温下制备与储藏 • 2.使用螯合剂消除金属催化反应 • 3.提高离子强度，减少二硫键的形成 • 4.消除过氧化物和金属污染物 • 5.避光 • 6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反
表面吸附
可能的解决方案
控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度 控制PH、缓冲液 硫醇的消除（如半胱氨酸）
防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
化学稳定性
• 1.PH、水解和缓冲液 • 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 • 3.其它化学不稳定性及制剂方法
应
• 7.生产过程中用氮或氩代替氧 • 8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可
能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。
• 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，
使用螯合剂
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下
显著加速；
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），
磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化
• 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度
能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。
• 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离
子强度。
• 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液
冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方 法
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导
致低物理稳定性。
• 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• 1.水解和脱氨反应
• 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺
• 影响因素：极端PH、温度和离子强度
• பைடு நூலகம்明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋
白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率