生物医学亲和层析相互作用
生物医学亲和层析相互作用
1概述
亲和层析属于液相色谱,它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原,也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。很多亲和配体具有很高的选择性,将偶联了配体的介质装在柱子中,可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。亲和层析介质主要由三部分组成:配体、间隔壁、基质。配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。根据配体的类型,可以将亲和层析进行分类,如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。在设计和使用亲和层析柱时,偶联配体所使用的基质的类型也很重要。以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。这种基质易于修饰和活化,有利于基质和配体的偶联,并且具有较好的物理化学稳定性,非特异性吸附少。但是这种基质的机械性能较差,在使用时柱压不能太高,分辨率和效率相对于高压系统也较低。对于高压液相亲和层析,可以使用二氧化硅颗粒或者整体柱材料为基质。采用这种基质的亲和层析柱可以用于HPLC或与其他分析方法(如质谱)联合运用。
2亲和层析应用的常见方式
首先,要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。将处理好的样品上到亲和层析柱上,与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出;然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂,使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。根据目标分子的性质,可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。亲和层析的分离过程简单、快速,具有较高的选择性,广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。另外,除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外,同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。如在蛋白组学的研究中,可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白,再研究低丰度蛋白。
3凝集素亲和层析
凝集素是一种非免疫来源的蛋白质,能识别并结合特定类型的糖基,广泛分布于植物、动物和微生物中。凝集素亲和层析以偶联了凝集素的基质为固定相,常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、榴莲凝素等,它
们能识别不同的糖基,广泛用于分离和鉴定糖蛋白、糖肽、糖脂、寡糖。
4硼酸盐亲和层析
硼酸盐亲和层析以硼酸盐为配体。在碱性条件下,大多数硼酸盐衍生物能与含顺式二醇基团的糖或糖蛋白结合。在过去的几十年中,临床实验室一直将其用于糖化血红蛋白的定量。糖化白蛋白以及一些载脂蛋白也可以用类似的方法来分析研究。等利用“点击化学”(clickchemistry)的方法合成了新的硼酸盐,可以用于分离糖蛋白如卵清蛋白和RNaseB。将硼酸盐和凝集素共同偶联到基质上,可以更好的用于分离糖蛋白。
5免疫亲和层析
免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。以抗体为配体,免疫亲和层析可以用于分离纯化激素、酶、多肽、病毒等。在临床实验室,该方法已经被用于分析乙酰胆碱酯酶、联苯胺、IgG、胰岛素、转铁蛋白等。以抗原或蛋白A/G为配体,可以对抗体进行纯化。
6金属螯合亲和层析
金属螯合亲和层析是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和基质上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。金属离子通过螯合剂固定在基质上,常用的离子有Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等,它们与氨基酸残基的结合能力有强有弱。金属螯合亲和层析可以用于药物检测前的样品预处理,还可以结合质谱用于疾病诊断标志物的检测。
7生物分子相互作用研究
亲和层析除了可以用于分离和测定靶分子,还可以用于研究生物分子的相互作用,如酶/抑制剂、蛋白/蛋白、蛋白/DNA等[11]。GSTpulldown就是一种研究蛋白相互作用的技术,其基本流程是:将“诱饵”蛋白与GST融合表达,当融合蛋白通过偶联了GSH的柱子时,可以通过GSH和GST的亲和作用而吸附在柱子上,把待测样品上到柱子上,与诱饵蛋白相互作用的蛋白就会被吸附到柱子上,再对其分析鉴定即可[12]。在生物医学和药物分析研究中,亲和层析已经成为一项常规的分离工具。通过使用不同的配体和基质,并结合其他技术和方法,来达到所需的应用目的。另外,亲和层析还可以用于研究生物分子的相互作用等,相信未来亲和层析的应用会越来越广泛。
层析技术的应用
层析技术的应用 一、层析技术的原理和分类 （一）层析技术的原理 层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。 层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 （二）层析法分类见表16-5～7 （三）层析法的特点与应用 表16-5按两相所处状态分类 层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层
析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。 表16-6按层析原理分类 表16-7按操作形式不同分类
亲和层析技术在生物科学中的应用及发展
亲和层析技术在生物科学中的应用及发展 摘要：近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化，是蛋白质组学研究中重要的技术之一。介绍了亲和层析的基本类型及配体合成的研究进展，概述了亲和层析技术在蛋白质组学以及在其他方面的应用和发展动态。 关键词：亲和层析；基本原理；类型；应用 亲和层析(amnitychromaloSraphy)是利用偶 联亲和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目 标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法， 近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，并在生 物技术产品、生物分子及组织的分离和纯化领域 取得令人瞩目的成就。现已广泛用于分离纯化蛋 白质、肽、酶及其底物和抑制剂、抗体及抗原、核酸 及其特异性作用物、激素及受体、细胞及细胞表面 物等等”。基于此，本文针对亲和层析的基本类 型，配体的选择和亲和层析在生物学特别是蛋白 质组学中的应用等方面作一介绍。 1 亲和层析的类型 亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。根据配体与生物大分子之间相 互作用体系不同，可以把亲和层析分为以下4种 类型。 1．1 生物亲和层析(BAFC) 生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特 异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的 选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、 激素—受体等。 1．2 免疫亲和层析(1AFC) 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另 一方的分离系统，称免疫亲和层析，免疫亲和层 析应用相当广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白 质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体， 目前，利用抗体－抗原模式，有可能得到每一种目
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
色谱法的分类及其原理
色谱法的分类及其原理 （一）按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 （二）按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 （三）按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：
1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。 2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，
亲和色谱技术研究进展
第３２卷第４期２００７年４月 上海化工ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ 摘要亲和色谱具有高选择、高活性回收率和高纯度等特点，已成为生物工程中分离纯化最有效的技术之一，是生物化工研究的重要方向。综述了亲和色谱技术及其发展趋势。 关键词亲和色谱研究进展生物化工 中图分类号Ｑ８１４．１ 第一作者简介：刘望才男１９７８年生博士研究生研究方向为化工技术在生物工程中的应用２７ ??
上海化工第３２卷 ［１］［２］［３］［４］液ｐＨ为４．２、０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（含０．５ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｃｌ），所得ＧＳＨ纯度可达４９．８％，平均提取率为６７．９％。 ３拟生物亲和色谱 近年来发展起来的以氨基酸（包括多肽）亲和色 谱和染料亲和色谱为代表的仿生亲和小分子配基新技术。对需要纯化的目标蛋白，在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基，然后将其固定到支持介质上，这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定，特异性及重复性更好［１１－１２］。 ３．１染料配基亲和色谱 染料配基能通过共价链牢固地结合到亲和载体 上。染料配基价格低廉，与蛋白质的结合容量大，并且不易为物理或化学物质所降解，因此是一种较为理想的基团特异性配基。 Ｓ．Ｃ．ＭｅＬｉｓｓｉｓ等［１３］研究了谷胱甘肽结构类似物 亲和吸附剂。所用的染料是二氯三嗪的模拟物，其中活性部分结构与谷胱甘肽类似。用此种亲和吸附剂分别纯化三种作用于谷胱甘肽的酶ＮＡＤ＋、甲醛脱氢酶和谷胱甘肽－Ｓ－转移酶，效果良好。 ３．２多肽亲和色谱 与金属和染料相比，多肽具有较高的特异性，且 通常是无毒的。多肽具有与蛋白质相似的结构，因此它们的作用通常是温和的，因此在分离过程中采取温和的洗脱条件，可以避免蛋白质的变性。 Ｈ．Ａｒｏｓｔｏｖａ［１４］等用碘化的Ｌ－酯氨酸与琼脂糖交联制备亲和色谱柱纯化猪胃蛋白酶，效果良好。Ｊｏｈｎ 等［１５］合成的双环八肽类似物，对肠促胰酶肽有很好的特异性吸附。 然而，自然界中存在的与蛋白质等生物大分子有天然亲和性的多肽种类非常有限。因此，必须找到并得到合适的特异性多肽。组合化学的进一步发展［１６］将为这一发展方向开辟道路。 ４亲和色谱和其他技术联用 过程集成（ＰｒｏｃｅｓｓＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）是一般化工加工过 程的重要研究方向［１７］。以下将对一些集成化的亲和色谱技术分别进行介绍。 ４．１亲和膜分离技术 亲和膜分离（ＡｆｉｎｉｔｙＭｅｍｂｒａｎｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ）是将 亲和色谱与膜分离技术结合起来以提高过程选择性 的一项新型分离技术。亲和膜分离技术，综合了两种方法的优点，而且互相互补克服缺点，具有传质阻力小、压降低、设备体积小、配基利用率高等优点［１８］。 亲和膜过滤技术研究的最早报道见于１９８０年［１９］。在国内，巳报道用于血清中内毒素［２０］等的分离纯化。 ４．２电泳亲和色谱技术 电泳亲和色谱技术（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）是将电泳与亲和色谱相结合形成一 种新型制备规模的生物分离技术。其基本思想是利用电场强化扩散过程以加速分离过程的进行。ＬｉｕＺ等［２１］发现亲和色谱过程施加电场后吸附过程的传质速率加快，动态吸附容量提高。 ４．３生物磁性亲和分离技术 磁性分离技术中引入磁性介质，在操作时通过 外加磁场的作用，可以提高传统生物分离技术的效率［２２］。Ｓａｆａｎｋ等［２３］则探讨了利用磁性颗粒进行细胞分离的方法。郭立安等［２４］合成了能用于万古霉素纯化用的磁性亲和载体，并从发酵液中一步纯化得到，可得到纯度达９７％以上的纯品。 ４．４膨胀床吸附色谱技术 传统色谱过程的最大不足是不能处理含固体颗 粒的料液，２０世纪９０年代产生的膨胀床吸附技术，将固－液流态化技术与色谱过程偶合，使吸附和淋洗过程大大加快，细胞碎片等不溶物从顶部排出，实现了离心、过滤和纯化的一体化操作［２５］。 ５展望 亲和色谱技术以其高选择性和可逆性开创了生 化分离的新纪元，随着临床对药用蛋白等生物工程产品需求的不断加大以及组合化学、基因工程等科学技术的高速发展，亲和色谱技术将迅速向前发展。 参考文献 孙彦．生物分离工程［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００４： １９３－２２６． 师贤，王俊德．生物大分子的液相色谱分离和制备［Ｍ］．北 京：科学出版社，１９９９：５１－１１５． 熊宗贵．生物技术制药［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９： １３５－１３９． ＢｅｒｒｕｅｘＬａｕｒｅＧ，ＦｒｅｉｔａｇＲｕｔｈ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇｔｏｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｇｒｏｕｐｓｐｅｃｉｆｉｃａｆｆｉｎｉｔｙｌｉｇａｎｄｓｉｎ ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｍｏｎｏｌｉｔｈａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，２０００（２４）：９５－１０４． ２８??
亲和层析技术
亲和层析技术 （一）原理 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 （二）载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。 可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。 琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒）
亲和膜色谱的研究进展
亲和膜色谱的研究进展 摘要：亲和膜色谱又称亲和膜分离，其在生物大分子的分离纯化中作为一种综合性的技术出现在80年代末。亲和膜色谱主要优点是克服了颗粒状多孔载体扩散传质阻力大的缺点，代之以对流传质，这样就可以在较低的操作压和较高的流速下对目标物进行快速的分离和纯化，从而缩短操作时间、提高纯化效率。本文介绍了亲和膜色谱的分离过程，评价了亲和膜基质材料活化、改性方法，给出了配基、间隔臂的选择原则，并简单介绍了亲和膜色谱技术的应用。 关键词：亲和膜色谱、分离过程、膜基质、配基、间隔臂、应用 Recent Advances in Affinity Membrane Chromatography Affinity membrane chromatography (AMC) was developed as an integrative technology for the purification of biomacromolecules in the end of 1980s. Affinity membrane are achieved by attaching affinity ligands to the inner suface of the through pores in microfiltration membranes. So the main feature of AMC is the elimination of pore diffusion that exists as the main mass-transfer resistance in conventional column chromatography with porous particles. In an AMC, target products included in a crude mixture can bind to the affinity ligands by passing througe the membrane. Thus，AMC can be operated at a high flow rate with a low pressure drop, resulting in a large throughput for protein purification. This article reviews the fundamental aspects of affinity membrane chromatography, separating process and its application. Activating and modifying methods of matrix materials are introduced. The principles of selecting ligands and spacer arms are elucidated. The advances in the theoretical aspect study and trends of AMC are also described. Keywords: Affinity membrane chromatography, membrane matrix, ligand, spacer arm, application 1 前言 近年来，生命科学和生物工程得到了迅速发展，蛋白、酶、多肽、疫苗等生物制品成本的30%～60%来自于分离过程。分离过程的成效已成为生物技术发展的一个重要方面。这些生物大分子一般都具有生物活性，一旦脱离了它们原来的生理环境，或与某些金属或载体相接处，很容易改变其分子构象，并失去其固有的活性。它们的热稳定性也比较差，有的需在恒温(如体温)才不变性，有的需在
亲和层析
固相萃取柱空柱 逗点生物提供的固相萃取柱空柱是制作固相萃取柱的基础工具，柱体选用高纯度医疗级的聚丙烯制成，筛板选用纯净的超高分子量聚乙烯加工而成，有广泛的溶剂兼容性。 30ml和50ml空柱管可以制备Flash柱。 我们提供用于制备固相萃取柱的筛板和空萃取柱，为科研研究服务，也为生产厂家提供配套。 点击了解详细规格 固相萃取柱空柱分类 固相萃取柱空柱，包括针筒型小柱、串联柱和离心柱等。 针筒型小柱串联柱离心柱 固相萃取柱空柱构成 装柱套件一般由柱体和筛板两部分构成，特殊应用时还需要盖子和推杆。 固相萃取柱空柱装柱步骤 1、装下筛板 用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到柱体底部。 2、加装填料 柱体垂直，将长颈漏斗置入柱体中，在漏斗中加入所需填料，轻轻提起漏斗，轻敲使填料上表面平齐。 注意：① 长颈漏斗的颈要有足够的长度，最好能基本接近下筛板；② 漏斗提起时应避免填料粘在柱体内壁上。 3、装上筛板 保持柱体垂直，用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到填料上表面。 注意：当填料上表面和上筛板之间还有空隙时，垂直状态轻敲柱体，再次用装柱工具把筛板推到适当位置。 产品选购指南 点击查看大图
亲和层析柱空柱 点击查看原图 产品/服务：其它实验耗材 品牌：biocomma 型号：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 规格：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 单价： 最小起订量： 供货总量： 发货期限：自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至： 2011-06-28 最后更新： 2010-09-19 浏览次数： 129 产品详细说明 亲和层析柱解决方案 亲和层析柱用筛板 逗点生物提供的亲和层析柱用筛板是选用纯净的超高分子量聚乙烯为原料，经独特的工艺加工而成。 高分子聚乙烯能耐受酸碱和一般的有机溶剂，对大部分的生物分子不会产生吸附，是固相萃取柱、亲和层析柱筛板最常使用的材料。 亲和层析柱空柱 亲和层析柱空柱管由医疗级的聚丙烯制成，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱管容量为3ml 、6ml 、10ml 、30ml 、50ml 。 亲和层析柱空柱 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。 如抗原和抗体，蛋白质A 与-些抗体，重组蛋白质和一些金属离子之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可相互解离。 当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。 亲和层析柱空柱概述 逗点生物提供的亲和层析柱空柱是专门为实验室小批量纯化抗体、重组蛋白或其它分子而设计，方便进一步进行科学研究。 亲和层析柱空柱所用的柱子为聚丙烯塑料，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWMPE 为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。 亲水性筛板采用了逗点生物领先的亲水性UHWMPE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它供应商相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低， 液体通过基质不均匀。 亲和层析柱空柱可配套针筒注射器、装柱推杆和联接管，方便柱子的装填并和蠕动泵等设备配套使用。 亲和层析柱空柱用于抗体纯化 金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A,SPA)能与人及多种哺乳动物血清IgG 分子中的Fc 片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛。 SPA 除与IgG 结合外，还能与血清中少量的IgM 和IgA 结合，SPA 菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG 为90%～98%，IgM 为2%～30%，IgA 为1.5%～20%。 纯化抗体一般用Protein A 作为纯化的配体，也可以用Protein G,Protein L 或异源性抗体作为配体。 点击查看大图
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理
胶体金标记的全定量免疫层 析技术的原理 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验（POCT）技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫：吸收多余液体。 2、 PVC底板：提供试剂封装外壳。 3、 C1、C2：标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、 T：检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜：提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫：含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫：吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获，形成显色反应，这种显色反应，既代表了整个反应体系是正确的，同时C1、C2区的显色反应的深浅，与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势，采用两点定标法是全定量的一个重要标志，只有两点定标才有可能实现真正的全定量。 2
蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备： 纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂： 所有上柱的试剂均需经μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L NiSO4: 称取 NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 操作步骤： 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经μM孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为 5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经
第5章 亲和层析
第5章 亲和层析 一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。 二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。 1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类： ①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。 2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。 3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。 三、亲和层析介质的制备： 1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。 2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。③机械性能良好，在一定静水压下不变形。④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。⑤化学惰性，无或微弱的非特异性吸附作用。⑥有良好的物理和化学的稳定性。常用的载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。凝胶类载体的特点：①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化，引入不同的基团。②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到活化，有较高的活化效率。③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小，分离效率
免疫亲和层析技术
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示：
凝胶层析法的基本原理
1.凝胶层析法的基本原理？ 答：层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。 2.凝胶层析法常用凝胶的种类和特点？ 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联 成的， 凝胶色谱法 经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶—P ( Bio-Gel P),由日本tosoh的TSKGE啲pw系列，适合蛋白和多糖的纯化。 交联葡聚糖凝胶 ⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚 糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25 为每克凝胶膨胀时吸水 2.5克，同样G-200克每克干胶吸水20克。交联葡 聚糖凝胶的种类有G-10，G-15, G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。 因此，“G'反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 ⑵Sephadex LH-20，是一Sephadex G -25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 琼脂糖凝胶 商品名很多，常见的有，Sepharose (瑞典，pharmacia )，
Bio-Gel-A （美国Bio-Rad ）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢 键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它 的结构是稳定的，可以在许多条件下使用 （如水，pH4-9范围内的盐溶液） 琼脂糖凝胶在40C 以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 聚苯乙烯凝胶 商品为Styrogel ，具有大网孔结构， 可用于分离分子量 1600到40,000， 000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级， 凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。 3. 不同性质的物料（热敏性、高粘度、易结垢或易析出晶体、发泡性、腐蚀性） 如何蒸 发浓缩设备？ 答：（一）循环型蒸发器 特点：溶液在蒸发器中循环流动，因而可以提高传热效果。由于引起循环 运动的原因不同。有分为自然循环型和强制循环型两类。 自然循环：由于溶液受热程度不同产生密度差引起 强制循环：用泵迫使溶液沿一定方向流动 1?中央循环管式蒸发器 中央循环管式蒸发器为最常见的蒸发器，其结构如图5-2所示, 它主 要由加热室、蒸发室、中央循环管和除沫器组成。蒸发器的加 热器由垂直 管束构成，管束中央有一根直径较大的管子，称为中央 循环管，其截面积 一般为管束总截面积的 40%-100%当加热蒸汽 （介质）在管间冷凝放热时， 由于加热管束内单位体积溶液的受热 面积远大于中央循环管内溶液的受热 面积， 因此，管束中溶液的相 凝胶色谱法 】如嘗主.2 3-中火咼环口,
亲和层析
亲和层析 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的应用 点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园 来源：互联网 亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1.抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。 另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。 2.生物素和亲和素 生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如
免疫亲和层析技术
免疫亲和层析技术 Prepared on 24 November 2020
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效
结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示： 图1. 免疫亲和层析原理图 三、实验目的