基础生化实验内容2012版
微生物生理生化反应实验报告
山东大学实验报告2012年 12 月 4日姓名系年级 2011级生科2班组别四科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应一、【实验目的】1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、【实验仪器与试剂】菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基；试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管三、【实验原理】1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。
生化基础实验报告
一、实验目的1. 了解生化实验的基本原理和操作方法。
2. 掌握常见生化试剂的制备和性质。
3. 学习并运用生化实验技术，进行物质的定性、定量分析。
二、实验原理生化实验是研究生物体内化学反应、生物分子结构与功能及其相互关系的实验方法。
本实验主要涉及以下内容：1. 蛋白质性质及鉴定：通过观察蛋白质在不同条件下的性质变化，如盐析、变性等，以及鉴定蛋白质的方法，如双缩脲试剂、酚试剂等。
2. 酶的性质及活性测定：通过观察酶催化反应的特点，如专一性、高效性等，以及酶活性测定方法，如比色法、电化学法等。
3. 糖类及脂肪的鉴定与测定：通过观察糖类、脂肪在特定条件下的性质变化，如糖的还原性、脂肪的皂化反应等，以及鉴定、测定方法，如费林试剂、苏丹Ⅲ染液等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、脂肪、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸锌、氯化钠、碘液、苏丹Ⅲ染液等。
2. 仪器：试管、烧杯、量筒、滴定管、pH计、电炉、恒温水浴锅、显微镜、离心机等。
四、实验步骤1. 蛋白质性质及鉴定实验（1）观察蛋白质盐析现象：取鸡蛋清溶液，逐滴加入饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质沉淀现象。
（2）观察蛋白质变性现象：取鸡蛋清溶液，加入少量氢氧化钠溶液，观察蛋白质变性现象。
（3）鉴定蛋白质：取鸡蛋清溶液，加入双缩脲试剂，观察颜色变化。
2. 酶的性质及活性测定实验（1）观察酶的专一性：取淀粉溶液，分别加入淀粉酶、蛋白酶，观察酶催化反应现象。
（2）测定酶活性：取淀粉溶液，加入淀粉酶，用碘液检测淀粉分解情况，计算酶活性。
3. 糖类及脂肪的鉴定与测定实验（1）观察糖的还原性：取葡萄糖、果糖溶液，加入费林试剂，观察颜色变化。
（2）观察糖的鉴定：取蔗糖溶液，加入苏丹Ⅲ染液，观察颜色变化。
（3）测定脂肪含量：取脂肪样品，加入碱液，加热皂化，测定皂化物的质量，计算脂肪含量。
五、实验结果与分析1. 蛋白质性质及鉴定实验（1）盐析现象：观察到鸡蛋清溶液中加入饱和硫酸铵溶液后，出现白色沉淀。
生化总蛋白实验报告
1. 理解生化总蛋白测定的原理和意义。
2. 掌握双缩脲试剂法测定血清总蛋白的操作步骤。
3. 学习如何通过实验结果分析血清总蛋白的含量及其临床意义。
二、实验原理血清总蛋白的测定通常采用双缩脲试剂法。
该法基于蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）反应，生成紫红色的络合物。
紫红色络合物的颜色深浅与蛋白质的含量成正比，通过比色法可以定量测定蛋白质的含量。
三、实验材料1. 实验试剂：- 小牛血清- 6.0mol/L NaOH 溶液- 双缩脲试剂（包括硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾）- 标准蛋白质溶液- 比色皿- 移液器- 离心机- 吸管- 酶标仪2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 离心机- 酶标仪1. 样品制备：取一定量的血清样品，按照要求进行稀释。
2. 标准曲线制作：取标准蛋白质溶液，按照试剂说明书进行稀释，制备一系列不同浓度的标准溶液。
将标准溶液分别加入比色皿中，加入适量的双缩脲试剂，混匀后放入恒温水浴箱中反应一定时间。
3. 样品测定：将制备好的血清样品按照步骤2进行操作。
4. 比色：将反应后的样品放入酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
5. 数据处理：根据标准曲线和样品的吸光度，计算样品中蛋白质的含量。
五、实验结果1. 标准曲线的制作：通过绘制标准曲线，得到吸光度与蛋白质浓度的关系。
2. 样品测定：根据标准曲线和样品的吸光度，计算样品中蛋白质的含量。
六、讨论和分析1. 实验原理：双缩脲试剂法测定血清总蛋白是一种常用的方法，具有操作简便、准确度高等优点。
2. 实验结果分析：通过实验结果可以了解样品中蛋白质的含量，从而评估样品的蛋白质水平。
3. 临床意义：血清总蛋白的测定在临床医学中具有重要意义，可以用于评估患者的营养状况、肝功能等。
七、注意事项1. 实验操作过程中应严格控制试剂的加入量，避免误差。
2. 样品制备过程中应避免污染，保证实验结果的准确性。
3. 实验操作过程中应遵守实验室安全规范，确保人身安全。
生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较
①容量瓶②试管及试管架
③恒温水浴槽④吸量管
⑤分光光度计⑥电热套
⑦锥形瓶⑧比色皿
(3)紫外吸收法
试剂:
样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。
器材:
①紫外分光光度计②容量瓶
③试管、试管架④吸量管
⑤锥形瓶⑥比色皿
4．实验方法步骤及注意事项
双缩脲法
标准曲线的绘制:
取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。
实验远没有我想象的那样简单，要想做好一个实验，容不得半点马虎。综合实验正是这培养了我们的耐心、恒心和信心，让我们的思维和创造力得到了大幅度的提高，让我们的科学素养有了很大的飞越。真真正正变学生的被动学习为主动学习，激发了我们的学习热情，不管实验成功或是失败，我们都能从中获得很多从其它地方得不到的知识，让我们获益匪浅！
若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
5.实验数据处理方法
双缩脲法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
O．D540
0
0.021
0.052
0.160
0.316
0.345
0.08
0.029
标准蛋白质浓度(mg/ml）
0
1
2
3
4
5
X
Y
考马斯亮蓝染色法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
蛋白质浓度（ug/ml）
样品测定:
①制备样品的蛋白质提取液。
②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份
计算:
基础生化实验
基础⽣化实验⽣化实验讲义验证型实验⽣物科学与⼯程学院实验⼀实验基本操作技能培训⼀、玻璃器⽫的洗涤与⼲燥1.玻璃器⽫的洗涤化学实验中经常使⽤的玻璃器⽫和瓷器，常常由于污物和杂质的存在⽽得不出正确的结果。
因此，在进⾏化学实验时，必须把器⽫洗涤⼲净。
玻璃仪器的洗涤⽅法很多，应根据实验的要求、污物的性质、沾污程度来选择。
常⽤的洗涤⽅法如下：(1)⽤⽔刷洗⽤⽔和⽑刷刷洗，再⽤⾃来⽔冲洗⼏次，可除去附在仪器上的尘⼟、可溶性和不溶性杂质。
注意洗刷时不能⽤秃顶的⽑刷，也不能⽤⼒过猛，否则会戳破器⽫。
(2)⽤去污粉、肥皂洗、洗⾐粉、洗涤剂洗去污粉由碳酸钠、⽩⼟、细砂等组成，它与肥皂、合成洗涤剂⼀样，能去除油污和⼀些有机物。
由于去污粉中细砂的摩擦和⽩⼟的吸附作⽤，使得洗涤的效果更好。
洗涤时，可⽤少量⽔将要洗的器⽫润湿，⽤⽑刷蘸取少量去污粉刷洗仪器的内外壁，最后⽤⾃来⽔冲洗。
⽤去污粉、洗⾐粉、洗涤剂洗这些洗涤剂可以洗去油污和有机物质。
若油污和有机物质仍然洗不⼲净，可⽤热的碱液洗。
(3)⽤铬酸洗液洗铬酸洗液是由浓硫酸和重铬酸钾配制⽽成的，具有很强的氧化性，对有机物和油污的去污能⼒特别强。
使⽤铬酸洗液时要注意被洗涤的器⽫内不宜有⽔，以免洗液被冲淡或变绿⽽失效。
能⽤⼀般洗涤剂洗净的器⽫，尽量不要选⽤洗液洗涤。
(4)⽤特殊的试剂洗应根据沾在器壁上污物的性质，采⽤合适的⽅法或药品来处理。
例如，沾在器壁上的⼆氧化锰⽤浓盐酸处理；AgCl沉淀可以⽤氨⽔洗涤；硫化物沉淀可选⽤硝酸加盐酸洗涤等等。
洗涤时应遵循“少量多次”的原则，⼀般以洗三次为宜。
2．玻璃器⽫的⼲燥可根据不同的情况，采⽤下列⽅法将洗净的仪器⼲燥：(1)晾⼲不急⽤的仪器在洗净后，可倒置在⼲净的实验柜内或仪器架上任其⾃然⼲燥。
(2)烘⼲将洗净的仪器尽量倒⼲⽔后放⼊烘箱内烘⼲。
放⼊烘箱前要先把⽔沥⼲，放置仪器时，仪器的⼝应朝下。
(3)吹⼲⽤吹风机或⽓流烘⼲器把仪器吹⼲。
3. 基本度量容器的使⽤和滴定分析的基本操作1)量筒量筒是实验中经常使⽤的度量液体的仪器之⼀，常见量筒的容量有10 mL、20 mL、50 mL、100 mL 、500 mL等，可根据需要来选⽤。
生化实验二报告
实验二蛋白质的呈色反应，沉淀反应实验人：刘彦汶学号：20100331024 班级：针外2010七同组人：曲畅试验日期：2012年3月15日指导老师：路雪雅一．实验目的1．了解蛋白质的性质。
2．掌握蛋白质的鉴定方法。
3．理解蛋白质呈色反应和沉淀反应原理。
二．实验内容1．蛋白质的呈色反应。
2．蛋白质的沉淀反应。
三．实验器材水浴锅（100摄氏度），试管（若干），烧杯，一次性滴管，酒精灯，漏斗，火柴，滤纸四．实验试剂1．1：10鸡蛋白溶液 2．10%NaOH 3．1%硫酸铜 4．尿素 5．0．1%茚三酮乙醇液 6．0．25%丙氨酸溶液 7．饱和硫酸铵溶液 8．固体硫酸铵 9．0．5%NaOH 10．0．5%硫酸锌 11．10%磺基水杨酸 12．10%Hcl 13．1%HAc 14．10%HAc 15.无离子水五．实验原理及操作步骤（一）蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应是蛋白质中某些氨基酸特殊基团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应，可作为检查蛋白质是否存在的参考。
另外，不同的蛋白质中氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质内还可能缺乏呈某种颜色反应的氨基酸。
因此不但不同蛋白质呈色反应的强度不同，而且某些呈色反应在某种蛋白质可能不存在。
本实验操作两种呈色反应：双缩脲反应与茚三酮反应，用以比较和鉴别不同的蛋白质。
1．双缩脲反应【实验原理】在浓碱液中，双缩脲能与硫酸铜结合生成紫色或紫红色的复合物，这一呈色反应为双缩脲反应，凡含有两个及多个肽键（酰胺键）的化合物都可能发生此反应，故蛋白质及二肽以上的物质都有此反应，但除肽键外，有些基团如—CSNH—，—C（NH2）NH—等也有双缩脲反应，因此，一切蛋白质或多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。
【操作】（1）取小试管一支，加1：10鸡蛋白液2滴，10%NaOH溶液5滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，可见溶液变成紫色。
（2）另取一小试管，加一小匙尿素（绿豆大小），小火加热至熔，嗅其气味为（臭鸡蛋味）。
微生实验报告 2012.12.实验十二、细菌常用生理生化反应实验结果观察测定
微生实验报告姓名：王晶晖专业年级：2011级生物技术学号：040312011032实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察一、结果观察1、葡萄糖发酵实验直接观察试管：试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌，不变者为阴性菌。
2、V. P. 反应和甲基红试验:将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌。
3、吲哚实验在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌。
4、硝酸盐还原实验在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌。
5、柠檬酸盐实验直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌。
6、明胶水解向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌。
7、淀粉水解实验向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌。
8、硫化氢产生实验直接观察培养好的培养基，出现黑色沉淀者为阳性菌，不变者为阴性菌。
二、实验结果1、葡萄糖发酵实验阳性：大肠杆菌（半固体培养基变黄，左图）阴性：恶臭假单胞菌（保持紫色不变，右图）2、V. P. 反应和甲基红试验：（1）V．P．实验阳性：大肠杆菌（加入40%的KOH溶液10～20滴，再加入等量的α-萘酚溶液，放入37℃恒温箱中保温15～30分钟，培养液出现红色，右图）阴性：产气杆菌（同上操作，培养基不变色，左图）（2）甲基红试验阳性：产气杆菌（加入 M．R．试剂3-4滴后变红，左图）阴性：大肠杆菌（加入 M．R．试剂3-4滴后不变色，右图）3、吲哚实验阳性：大肠杆菌（乙醚层呈现玫瑰红色，右图）阴性：产气杆菌（左图）4、硝酸盐还原实验阳性：大肠杆菌（滴入革里斯试剂后变红，左下图）阴性：恶臭假单胞菌（滴入二苯胺试剂后变蓝，右上图）5、柠檬酸盐利用实验阳性：产气杆菌（溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色，右图）阴性：大肠杆菌（斜面培养基不变色，左图）6、明胶水解实验阴性：大肠杆菌（菌落周围没有出现透明圈，上图）7、淀粉水解实验阳性：枯草杆菌（加入碘液，菌落周围出现透明圈，下图）阴性：大肠杆菌（菌落周围没有出现透明圈，上图）8、产硫化氢实验阳性：变形杆菌（出现黑色沉淀，左图）阴性：大肠杆菌（未出现黑色沉淀，右图）思考题1、你的实验结果与实验预期是否相同？如果不同试分析原因。
生化检验相关实验简化版
一、血糖检测：--糖尿病1、葡萄糖氧化酶法：过氧化物酶；4-氨基安替比林和苯酚氧化缩合生成红色的醌类化合物（Trinder反应）；505nm2、己糖激酶法：NADPH 340nm二、血清总蛋白检测：1、微量凯氏定氮比色法：纳氏试剂（碘化钾汞复盐），棕黄色440nm2、双缩脲法：540nm3、血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳分析：等电点不同，从正极开始：白蛋白，α1，α2，β，γ三、血清白蛋白检测1、电泳法2、免疫化学法3、染料结合法（溴甲酚绿BCG），最常用，无需分离白蛋白和球蛋白；蓝绿色630nm。
四、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定--肝功能损害1、赖氏比色法：丙氨酸，α-酮戊二酸；2,4-二硝基苯肼（腙）红棕色505nm五、血清（尿）淀粉酶检测--急性胰腺炎1、碘-淀粉比色法：AMY：淀粉酶蓝色660nm六、血清乳酸脱氢酶测定—心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤1、LD, 2,4-二硝基苯肼（腙）红棕色440nm七、血清肌酸激酶（CK）测定—骨骼肌、心肌、脑组织，心肌梗死、多发性肌炎、休克1、比色法：无机磷酸法、酶偶联丙酮酸测定法、肌酸显色法（常用）：A TP，肌酸与双乙酰和α-萘酚生成红色化合物；540nm2、速率法3、荧光分析法八、血清碱性磷酸酶（ALP）测定—肝胆系统、骨骼系统1、氨基安替比林比色法：ALP在碱性条件下使磷酸苯二钠水解，生成磷酸和游离酚，后者与4-氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氧化成红色醌类化合物，510nm。
2、速率法：ALP在碱性条件下，使磷酸对硝基苯酚（4-NPP）释放出磷酸基团，生成磷酸基团和游离的对硝基苯酚（4-NP），形成黄色的醌，405nm九、血清γ-谷氨酰基移换酶（GGT）测定—肝胆系统1、底物：L-γ-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺；受体：双甘肽，在GGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同时释放出黄色的3-羧基-对硝基苯胺，405nm十、血清三脂酰甘油测定—动脉硬化1、分溶抽提-乙酰丙酮显色法：皂化反应、甘油、过碘酸。
最新基础生物化学实验
基础生物化学实验《基础生物化学》课程实验教学大纲课程编号：3011010 学时：32 学分：2一、课程的性质和任务“基础生物化学实验”是采用生物化学的原理和方法探究植物生命现象化学本质的实验科学。
它是植物生产类、环境资源类各专业重要的专业基础实验课程。
本课程讲授基础生物化学实验方面的基本理论，着重进行实验技术方面的系统训练，并安排综合实验及综合实验报告写作训练。
二、教学内容和方法教学内容分为基础生化实验理论讲授（4学时）和实验操作（28学时）两部分，以实验操作为主。
实验理论讲授离心技术、电泳技术、层析技术和分光光度技术的基本原理和方法。
实验操作安排多次基本实验、1-2次综合实验或设计实验。
基本实验1人1组。
综合实验和设计实验4-8人1组，每人独立操作。
课程安排与基础生物化学理论课程同步，在第4学期进行。
三、教学目的和要求通过实验理论学习、实验技术训练及实验技术的综合应用，提高学生的实验技能，培养学生的实验能力和创新思维能力，为应用生物化学实验手段进行科学研究奠定基础。
实验前要求预习，检查预习报告。
基本实验每人独立完成实验操作并交实验报告。
以技术为主的基本实验完成后进行操作考核。
综合实验每组做4-8个样品（或处理），1人做1个样品（或处理），以组统计数据，每人撰写1份综合实验报告。
教学结束后，在教材的思考题范围内进行实验笔试。
四、考核方式及办法实验成绩以预习5%，操作15%，实验报告40%，综合实验报告10%，实验笔试30%，进行综合评定。
实验课指导教师可以一次考核实验或多次检察现场评定预习和操作成绩；实验报告和综合实验报告成绩以批阅分数评定，实验笔试在期末进行全校统考。
五、配套的实验教材或指导书实验教材采用《植物生理生化实验教程》（第2版），叶尚红主编，云南科技出版社，2007、2。
六、适用专业植物生产类和环境资源类各专业。
在选择实验内容时可考虑与专业结合。
七、实验项目：(28学时)在下列实验中选做28学时，并开设2-3组综合实验或设计实验基础生物化学实验技术基本原理：(理论课讲授4学时)1、离心技术离心技术的基本原理, 离心机的种类、用途，普通离心机的使用注意事项，使用普通离心机分离提取DNA或RNA。
生化实验
实验仪器
粉粹机、恒温水浴锅、离心机、 粉粹机、恒温水浴锅、离心机、 蒸馏装置、烧杯、离心管、搅拌棒 蒸馏装置、烧杯、离心管、 天平等 紫外可见光分光光度计
实验步骤
备料：选成熟、干燥、无虫蛀、 备料：选成熟、干燥、无虫蛀、无霉烂 的蒜头，去蒂、分瓣、剥内衣， 的蒜头，去蒂、分瓣、剥内衣，用清水 漂洗，除去不合要求的蒜粒共200 g。 漂洗，除去不合要求的蒜粒共200 g。 酶解：用粉碎机将大蒜粉碎后, 酶解：用粉碎机将大蒜粉碎后, 加入少 量的蒸馏水，加盐酸调pH pH至 量的蒸馏水，加盐酸调pH至5，加0．2 纤维素酶(活力单位约2 u·g-1)， ％纤维素酶(活力单位约2 000 u·g-1)， 充分搅拌， 40℃恒温水浴中 恒温水浴中0 充分搅拌，置40℃恒温水浴中0．5 h
精测： 精测： 半胱氨酸溶液,加 测A0：取0.5 mL 1.0 mmol/L半胱氨酸溶液 加1.0 ： 半胱氨酸溶液 mmol/L DTNB溶液 mL,用50mmol/L pH7.5的 溶液1 溶液 用 的 Tris-HCl缓冲溶液稀释至 缓冲溶液稀释至5.0mL,26℃保温 缓冲溶液稀释至 ℃保温15 min,412 nm波长测定其吸光值 。 波长测定其吸光值A0。 波长测定其吸光值 测A：取1.0 mmol/L半胱氨酸溶液 ： 半胱氨酸溶液0.5 mL,加0.5 加 半胱氨酸溶液 mL适量稀释的待测液 ℃保温 min后加 适量稀释的待测液,26℃保温15 后加1.0 适量稀释的待测液 后加 mmol/LDTNB溶液 mL,用50 mmol/L pH7.5的 溶液1 溶液 用 的 Tris-HCl缓冲溶液稀释至 缓冲溶液稀释至5.0mL,26℃下保温 缓冲溶液稀释至 ℃ 15min,412nm波长测定半胱氨酸吸光值 根据公式 波长测定半胱氨酸吸光值A,根据公式 波长测定半胱氨酸吸光值 算出其含量。 算出其含量。
11生本基础生物化学2
《基础生物化学》实验大纲课程编码：060133课程性质：必修课教学对象：生物科学专业学时学分：36学时2学分编写单位：生物科学与化学系编写人：陈仕学梁琍审定人：高健强编写时间：2012 年8 月一、课程说明1.课程基本情况课程名称：基础生物化学实验英文名称：Biochemistry Experiment课程编号：060133开课专业：09生物科学开课学期：第四学期是否独立开设实验：否课程学分/周学时：（实验学时：36 实验个数：14 实验学分：）课程类型：专业基础课实验2．课程性质（本课程在该专业的地位作用）专业必修3．本课程的教学目的和任务通过实验教学使学生巩固理论教学的基本原理，基本概念，真正掌握生物化学的基本实验技能和操作方法，同时在实验教学过程中，培养学生独立工作和研究、创新的能力，训练学生分析问题、解决问题的能力，训练科学思维，培养学生科学工作作风，并为后续专业课的学习打好基础。
4．本课程与相关课程的关系、教材体系特点及具体要求《生物化学》是在分子水平上研究生命活动规律的科学，这些规律来自严格的实验研究，《生物化学实验》是生物专业的一门专业基础实验课，是学生学习生物化学的重要组成部分。
生物化学实验教学要求：1).遵守实验室规则，爱护实验仪器设备。
2).实验前要充分预习实验指导，做好实验记录，认真完成实验报告。
3).实验操作要细心谨慎，严格遵守操作规则，注意安全。
4).实验完毕，注意关闭灯、电、火、窗5).实验报告的格式形式应统一。
封面应包括：课程名称、实验序号、名称、专业、班级、姓名、同组实验者、实验时间。
6).编写实验报告要规范，应包括：实验名称、目的、内容、原理、设备及仪表（名称、规格、型号）、实验装置或连接示意图、实验步骤、实验记录、数据处理（或原理论证、或实验现象描述、或结构说明等）及结果讨论。
7).实验报告应附有实验原始记录。
8).指导教师对每个学生的实验报告认真批改、评分、签字。
生物化学实验内容(二)
生物化学实验内容（二）引言概述：生物化学实验是生物学和化学相结合的实验，旨在探究生物体内化学过程和反应机制。
本文将介绍生物化学实验的内容，包括酶活性测定、蛋白质分离与纯化、核酸提取和分析、生物膜模型的构建以及基因克隆实验。
通过这些实验，我们可以深入了解生物体内的分子机制，为生物医学研究和药物开发提供重要的实验基础。
正文内容：1. 酶活性测定- 酶的选择和提取方法- 酶活性检测的原理和方法- 酶动力学参数的计算和分析- 酶的变性和抑制实验方法- 酶的催化机制和反应动力学的实验研究2. 蛋白质分离与纯化- 蛋白质提取和组织裂解方法- 蛋白质分离的凝胶电泳原理和方法- 蛋白质纯化的柱层析方法和技术- 蛋白质结构和功能研究的实验策略- 蛋白质鉴定和定量的质谱分析方法3. 核酸提取和分析- 核酸提取的方法和材料选择- 聚合酶链式反应（PCR）的实验原理和步骤- DNA测序和序列分析的实验技术- RNA的转录和翻译实验方法- 基因表达和调控的实验研究4. 生物膜模型的构建- 磷脂类生物膜的制备方法- 生物膜相关蛋白的定位方法- 生物膜的功能和透过性研究实验- 生物膜与药物相互作用的实验策略- 膜蛋白结构和功能分析的实验技术5. 基因克隆实验- DNA片段的扩增和限制性酶切- 载体构建和转化的实验步骤- 基因突变和基因敲除的实验方法- 基因表达和蛋白质产量的测定- 基因编辑和CRISPR-Cas9的应用总结：生物化学实验的内容涵盖了酶活性测定、蛋白质分离与纯化、核酸提取和分析、生物膜模型的构建以及基因克隆实验。
通过这些实验，我们可以深入了解生物体内的分子机制，为生物医学研究和药物开发提供重要的实验基础。
通过实验结果的进一步分析和研究，我们可以揭示生物体内的化学反应过程，并推动科学技术的进步。
生化实验教案
生化实验教案第一篇：生化实验教案生命科学与技术学院生化实验（下）生物化学实验（下）实验三离子交换柱层析法分离氨基酸生命科学与技术学院生化实验（下）华中科技大学生命科学与技术学院 2012级生物化学小老师第三组离子交换柱层析法分离氨基酸【实验目的】1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。
2.掌握离子交换柱层析的基本操作。
3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】1.离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH 等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：或这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。
功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。
可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带生命科学与技术学院生化实验（下）同种电荷的离子进行交换反应。
因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。
带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。
生化实验报告
生化实验报告引言本实验旨在研究生物体内的化学反应和生化过程。
通过对不同生物体进行实验观察和数据分析，我们将探索生物体内的基本生化反应以及其对生物体功能和健康的影响。
本报告将详细描述实验设计、实验过程、结果分析和结论，并提出进一步研究的建议。
实验设计本实验选择了两种不同的生物体：植物和动物。
我们分别对这两种生物体进行了以下实验设计：实验一：植物生化反应观察1. 准备不同种类的植物标本，包括叶片、茎和根部。
2. 将标本分别置于试管中，加入适量的生理盐水。
3. 在不同的环境条件下观察标本的生化反应，如光照、温度和湿度等。
4. 记录观察到的生化反应现象，如色素变化、气体释放等。
实验二：动物生化反应观察1. 准备不同种类的动物标本，包括血液、肌肉和器官组织。
2. 将标本分别置于试管中，加入适量的生理盐水。
3. 在不同的环境条件下观察标本的生化反应，如温度、pH值和添加特定物质等。
4. 记录观察到的生化反应现象，如酶活性变化、蛋白质分解等。
实验过程以下是实验的具体步骤和操作：实验一：植物生化反应观察1. 准备好所需的植物标本，并确保其新鲜度和完整性。
2. 将标本分别放置于不同的试管中，并加入适量的生理盐水。
3. 将试管放置于不同的环境条件下，如光照箱、恒温箱和湿度控制器中。
4. 观察标本在不同环境条件下的生化反应现象，并记录下来。
实验二：动物生化反应观察1. 准备好所需的动物标本，并确保其新鲜度和完整性。
2. 将标本分别放置于不同的试管中，并加入适量的生理盐水。
3. 将试管放置于不同的环境条件下，如恒温水浴、酸碱平衡溶液中。
4. 观察标本在不同环境条件下的生化反应现象，并记录下来。
结果分析根据实验观察和数据记录，我们得出了以下结果：实验一：植物生化反应观察1. 不同植物标本在不同环境条件下表现出不同的生化反应。
2. 光照条件对植物叶片的色素合成和光合作用有显著影响。
3. 温度和湿度条件对植物的新陈代谢和生长速率有一定影响。
生化实验一
③加热
变性
等电点易沉淀 偏酸、偏碱变性但不易沉淀
加热首先是加热使蛋白质变性， 有规则的肽链结构被打开呈松散状不 规则的结构，分子的不对称性增加， 疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的 蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清 都凝固。
④重金属盐沉淀 pH>pI 时带负电荷
与Cu2+ 、Ag+ 、Hg2+ 、Pb2+ 沉淀
Abstract: Purpose: (1)Study the extraction method of protein. (2) Master the usage principle of centrifuge. Method: salting out Result:We can get crude extraction of casein from pure milk by salting out.
②分类：电泳
α-酪蛋白(75％) ：23.6 kDa，三种变异型
β-酪蛋白(22％) ：24.0 kDa，七种变异型
γ-酪蛋白(3％)
к-酪蛋白：19.0-20.0 kDa，两种变异型
③密度：1.25～1.31 ④性状：纯酪蛋白为白色至浅黄色颗粒
或粉状，无臭无味。
⑤溶解情况：微溶于水及有机溶剂，溶
血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于
检验尿中蛋白质。
2.沉淀与变性的关系
①变性的蛋白质不一定沉淀 但并不沉淀。变性的蛋白更容易消化。
如煮沸的牛奶，其中的酪蛋白已经变性，
②沉淀的蛋白质不一定变性
如盐析、低温下有机溶剂沉淀的
蛋白质。
③凝固的蛋白质既沉淀又变性 如酸牛奶的pH已接近有关蛋白 质的pI，一旦煮沸便蛋白质开始变性， 蛋白质即结絮沉降下来。
基础生化实验内容(网络)
实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量【实验目的】学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。
染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。
本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。
【实验材料、仪器及试剂】1．材料：新鲜的植物材料2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml（2）考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。
在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。
2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。
表1-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。
【结果计算】C × VT样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝V S ×WF×1000式中：C为查标准曲线值（ug）；V T为提取液总体积（ml）；V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）。
实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定【实验目的】学习掌握鲜材料中游离氨基酸含量测定的原理和方法。
【实验原理】当氨基酸与水合茚三酮共热时，能定量地生成酮茚胺。
该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。
其最大吸收值在570nm ，并在一定范围内与氨基酸含量成正比。
氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。
生化实验
双缩脲法
实验目的
• 1.熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。 1.熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。 • 2.掌握血清总蛋白测定的临床意义。 2.掌握血清总蛋白测定的临床意义。
实验原理
• 双缩脲（H2N-OC-NH-NH2) 双缩脲（H OC-NH在碱性溶液中于铜离子作 用生成稳定紫色络合物， 即双缩脲反应。蛋白质分 子中肽键（-CO-NH子中肽键（-CO-NH-）在 碱性环境中于铜离子形成 紫色络合物（在540nm出 紫色络合物（在540nm出 游明显吸收峰，吸光度在 一定范围内与蛋白质的含 量成正比，因此常用于蛋 白质的定量测定。
注意事项
• 1.酒石酸钾钠络合铜离子，维持在碱性溶液中溶解性，碘 1.酒石酸钾钠络合铜离子，维持在碱性溶液中溶解性，碘 • • •
化钾防止二价铜还原。 2.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用 2.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用 mol/L表示，而用g/L表示。 mol/L表示，而用g/L表示。 3.高脂、黄疸及溶血标本应作血清空白对照来校正误差。 3.高脂、黄疸及溶血标本应作血清空白对照来校正误差。 4.本法绘制的标准曲线时一条通过原点的直线，在100g/L 4.本法绘制的标准曲线时一条通过原点的直线，在100g/L 之内呈现良好的线性关系。
实验试剂
• 1.生理盐水 0.9gNaCl定容100ml 1.生理盐水 0.9gNaCl定容100ml • 2.双缩脲试剂 称取CuSO4·5H2O 3.0g溶于500ml 2.双缩脲试剂 称取CuSO 3.0g溶于500ml
•
•
蒸馏水中，加NaKC 蒸馏水中，加NaKC4H4O6·4H2O 9.0g，KI5.0g，待 9.0g，KI5.0g，待 溶解后，加24%NaOH100ml，稀释到1L，置聚氯 溶解后，加24%NaOH100ml，稀释到1L，置聚氯 乙烯瓶内盖紧保存。 3.蛋白质标准液：收集混合血清（无黄疸、无溶 3.蛋白质标准液：收集混合血清（无黄疸、无溶 血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人 血清），用凯氏定氮法定值，用作蛋白质标准液。 贮于冰箱中备用。 4.用生理盐水按1：10稀释待测血清。 4.用生理盐水按1 10稀释待测血清。
2012-阎-实验五或九-碳源氮源的利用实验-大肠杆菌生长曲线的测定
皿底标记菌种的名称
2.加待测碳源、氮源底物
待菌液被培养基吸收后，用镊子夹灭菌滤纸 分别沾取碳源、氮源测试溶液，再将滤纸 贴于涂菌平板上，每皿共贴3片滤纸。皿 底做好标记。
3、培养与观察
每小组的碳源、氮源平板用报纸包成1筒，标记组 号，放37 ℃培养。 根据滤纸片周围的菌体生长状况，判断不同菌株对 几种氮源、碳源的利用能力。
待测碳源底物
0.2％醋酸，1％葡萄糖，0.5％牛肉膏溶液 (正对照)
碳源底物有糖类、醇类、脂肪酸类、双羧酸类、有机酸类、氨 基酸类等。一般底物要求过滤除菌，糖醇类浓度为0.5％-1％， 其他为0.1％-0.2％
氮源实验基础培养基
KHPO4 1.36g CaCl2· 2O 0.1g Na2HPO4 2.13g 葡萄糖 10g 2H
实验八
碳源、氮源的利用实验、
大肠杆菌生长曲线的测定
实验(一) 碳源、氮源的利用实验
一、实验目的
掌握微生物利用碳源、氮源的测定方法
二、实验原理
细菌的代谢具有多样性，因此在分类鉴定中，常可 以借助于它们在生理生化上的不同反应来进行分类 鉴定； 不同的细菌具有不同的酶系统，导致其能利用的碳 源、氮源不同； 在基础培养基上只添加一种有机碳源或者氮源，接 种细菌后观察细菌的生长状况，测试微生物利用不 同碳源、氮源的能力
最大概率法
待测菌液经十倍系列稀释，每稀释度做3-5 个重复，经培养后，检查细菌的生长，以有细 菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标， 由数理统计表查出近似值，再乘以数量指标第 一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。为概值。
光电比浊法
光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 测定时所吸收的光线越多。
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实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量【实验目的】学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。
染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。
本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。
【实验材料、仪器及试剂】1．材料：新鲜的植物材料2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml（2）考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。
在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。
2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。
将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。
【结果计算】C × V T样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝V S×W F×1000式中： C为查标准曲线值（ug）； V T为提取液总体积（ml）；V S 为测定时加样量（ml）； W F为样品鲜重（g）。
实验二植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
(2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。
(3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1 000ml 蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。
(4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。
(5) 终止液：2mol/L H2SO4。
（6）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度))。
操作步骤1．样品中激素的提取（1）称取0.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻半小时后，保存在-20℃的冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。
（2）4℃下提取4h，3500转/min离心8min, 取上清液。
沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。
（3）上清液过C-18固相萃取柱。
具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。
（4）将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容（一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容，测定不同激素时还要稀释适当的倍数再加样）。
2．样品测定（本指南所用的量是按一块96孔板计算的）竞争：即加标准物、待测样和抗体。
加标样及待测样：取适量所给标样用样品稀释液配成：IAA，ABA， ZR标准曲线的最大浓度为100ng/ml,GA的最大浓度为50ng/ml，JA-ME 的最大浓度为200ng/ml。
然后再依次2倍稀释8个浓度（包括0ng/ml ）。
将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复两孔，每孔50μl。
加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1：2000，就要加2.5μl的抗体）,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
竞争条件37℃左右0.5h。
洗板：将反应液甩干并在报纸上拍净。
第一次加入洗涤液后要立即甩掉。
然后再接着加第二次。
共洗涤四次。
加二抗：将适当的酶标二抗加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
洗板：方法同竞争之后的洗板。
加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全溶解后加4μl 30% H202混匀（显色液要现用现配），在每孔中加100μl，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。
比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。
结果计算：用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。
曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml ）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。
Logit值的计算方法如下：B/B0 BLogit（B/B0）=ln———— =ln————1-B/B0 B0-B其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值。
待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）。
求得样品中激素的浓度后，再计算样品中激素的含量（ng/g·fw）。
实验三酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响（一）酶的特异性【实验原理】酶具有高度的特异性，一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物，如淀粉酶，只能催化淀粉水解，而不能使蔗糖水解。
本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用，来说明酶的特异性。
【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。
2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液3．0.5%蔗糖液4．Benedict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3（无水）100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。
（可长期保存）。
【实验步骤】1．取试管两支，一支加入0.5%淀粉液2mL，另一支加入0.5%蔗糖液2mL；2．于两支试管中各加入制备好的唾液1mL；3．将两支试管同时放入37℃恒温水浴箱中保温；4．15分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；5．将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；6．取出两试管，观察记录颜色的变化，并注意有无红色沉淀产生，为什么？（二）温度对酶活性的影响【实验原理】酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行，使酶促反应速度最大时的温度称为此酶的最适温度，低于此温度，酶促反应速度缓慢，高于最适温度，酶蛋白变性失活。
本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例，说明温度对酶活性的影响。
【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。
2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液3．KI-I溶液【实验步骤】1．取三支试管并编号，同时各加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；2．将管1、管2、管3同时分别放入冰浴，37℃水浴，沸水浴中；3．15分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化，并解释此现象。
（三）pH对酶活性的影响【实验原理】在一定条件下，酶活性最高时的pH值称为最适pH，偏离此pH，酶活性就会有所下降，不同酶的最适pH不同。
例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。
本实验以入唾液淀粉酶（最适pH6.8）在不同pH条件下水解淀粉为例，说明pH对酶活性的影响。
【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。
2．pH1.5溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；2．pH6.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸溶液18.2mL；3．pH9.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸溶液2.2mL，然后用0.1N NaOH 调至pH9.8。
【实验步骤】1．取试管3支并编号，如下表加入各试剂；2．3支试管同时放入37℃恒温水浴箱内保温；3．15分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加1滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。
实验四淀粉酶活性的测定【实验目的】本实验的目的在于掌握分别测定这两种淀粉酶的方法。
【实验原理】淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5—二硝基水杨酸试剂测定。
由于麦芽糖能将3，5—二硝基水杨酸还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。