酵母表面展示技术ppt课件
细菌与酵母表面展示技术课件
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细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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16Βιβλιοθήκη 细菌与酵母表面展示技术17
细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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酵母菌表面展示操作步骤之酵母菌表面展示及分析
酵母菌表面展示操作步骤之酵母菌表面展示及分析酵母菌表面展示是一种常用的技术手段，用于展示特定蛋白质或多肽在酵母菌表面的表达情况。
这种技术可以用于基因工程、疫苗研究、抗体产生等领域。
酵母菌表面展示的操作步骤如下：1. 获得目标基因首先，需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法获得，如人工合成、提取已有菌株的DNA等。
确保DNA序列准确无误。
2. 克隆目标基因将目标基因克隆到酵母菌表面展示载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，并与表达载体连接，然后将连接产物转化到酵母菌中。
3. 酵母菌的培养和诱导表达将克隆了目标基因的酵母菌进行培养，可以使用液体培养基或固体培养基。
在适当的培养条件下，如适宜的温度、氧气含量和pH值下，培养酵母菌。
当酵母菌达到适当生长阶段时，加入适宜的诱导剂，促使目标基因的表达。
4. 毛细管电泳检测经过一段时间的诱导表达后，可以进行毛细管电泳检测。
这是一种常用的酵母菌表面展示分析方法，可用于定量和质量分析。
5. 通过Western blot检测表达蛋白将经过毛细管电泳分离的样本进行Western blot分析。
这是一种常见的蛋白质检测方法，可用于检测目标基因在酵母菌表面的展示情况。
6. 电镜观察使用透射电子显微镜观察酵母菌表面展示的情况。
通过电镜观察，可以直接看到目标基因在酵母菌表面的定位和分布情况。
7. 流式细胞术分析使用流式细胞仪对酵母菌表面展示样品进行分析。
流式细胞仪可用于检测和计数表面展示目标基因的酵母菌的数量和质量。
8. 结果分析和解释根据以上步骤获得的数据和结果，进行数据分析和结果解释。
根据需要，可以进行进一步的实验和验证。
总之，酵母菌表面展示操作步骤包括获取目标基因、克隆目标基因、酵母菌的培养和诱导表达、毛细管电泳检测、Western blot检测、电镜观察、流式细胞术分析以及结果分析和解释。
这些步骤是酵母菌表面展示研究中的关键环节，可以帮助研究人员获得目标基因在酵母菌表面的表达情况。
细菌与酵母表面展示技术ppt课件
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Schreuder等未来自瓜儿豆
胶的α-半乳糖苷酶的基因插入
到酿酒酵母转化酶分泌信号和
α-凝集素C端部分编码序列之间
。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶
-α-凝集素〔α-Gal-ACI〕交融蛋
与α-凝集素类似的衔接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白பைடு நூலகம்成。
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酵母外表展现系统运用在酿酒酵母的α-凝集
素将外源蛋白质展现与细胞外表。α-凝集素由中心亚
单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，
Agalp
•
共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母
谢谢欣赏
1.目的蛋白-α-凝集素外表展现系统
• 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分交融， 目的蛋白经α-凝集素展现酵母细胞外表。α-凝集素共价衔 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发扬 作用。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进展挑 选和分别，这就使得基于特异定量亲和力改动的 的突变体分别成为能够。由于酵母展现的蛋白质 是严密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的运用前景。
• 前景：
• 外表展现技术日新月异，酵母展现系统在不断的完善和改 良，在多个领域得到广泛运用。由于其是真核细胞展现系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展现具有独特的 优越性，置信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研讨 方面发扬越来越重要的作用。
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选酵母菌表面展示是一种常用的生物技术方法，通过将目标蛋白质展示在酵母菌表面，可以方便地筛选和分析目标蛋白的性质和功能。
本篇回复将介绍酵母细胞转化和筛选的操作步骤。
1. 酵母细胞培养首先，准备酵母菌的培养基，可选择含有适当营养物质的液体培养基或固体培养基。
将培养基加热至适温（通常为30°C）后，将酵母菌培养基中接种适量的酵母细胞。
培养室环境应保持洁净，避免杂菌的污染。
2. 酵母细胞转化酵母细胞转化是将外源DNA导入酵母细胞的过程。
常用的方法有化学法、电穿孔法和冷冻转化法等。
化学法是最常用的方法之一。
首先，将目标DNA与载体质粒进行连接。
然后，将该DNA与酵母细胞混合，加入聚乙二醇和锂盐缓冲液，并进行热胁迫。
此时酵母细胞的细胞壁会变薄，使DNA能够进入细胞。
最后，将转化混合物分别进行热立体电转，温度变化会让酵母细胞摆脱聚乙二醇，转化DNA进入细胞内。
电穿孔法在酵母细胞转化中也被广泛使用。
该方法通过施加高压电脉冲来使细胞膜通透，从而使DNA能够进入细胞内。
冷冻转化法则通过将酵母细胞与DNA混合后迅速冷冻来实现DNA导入。
冷冻对酵母细胞膜的完整性要求较高，因此通常需要较高的转化效率。
3. 筛选转化酵母细胞筛选转化酵母细胞是为了找出具有目标蛋白质表面展示的细胞株。
常见的筛选方法包括基于细胞生长特性的选择筛选和基于蛋白质表达的筛选。
基于细胞生长特性的选择筛选方法利用某些基因的突变导致细胞对特定抗生素的敏感或抗药性来筛选细胞。
例如，将转化酵母细胞接种在含有某种抗生素的培养基上，只有表达了目标蛋白的细胞才能生长。
基于蛋白质表达的筛选方法则通过蛋白质表达水平的检测来筛选细胞。
常用的方法包括免疫检测、荧光标记和酶活检测等。
例如，可以利用特异性抗体来检测目标蛋白的表达情况，或者利用荧光蛋白标记来可视化表达目标蛋白的细胞。
4. 确认目标蛋白质表面展示在筛选出合适的酵母细胞株后，需要进行确认，确保目标蛋白质确实表达在酵母菌的表面。
酵母细胞表面展示
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Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、 质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道 蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母 恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个 流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法 进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离 子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设 计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假 阳性的剔除提供了一个快速的二次检验方法。
• 絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮 凝功能结构域识别酵母细胞 壁中的甘露聚糖链并非共价 作用诱导细胞粘附、聚集成 可逆性絮状物。
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酵母表面展示技术的特点
特点
表达偏差 小
筛选、纯 化、活性 测定方便
融合蛋白 相对分子 质量范围
酵母细胞表面展示技术及其在高通 量筛选中的应用
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目录
• 酵母细胞表面展示技术的概述 • 酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用
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酵母细胞表面展示技术的概述
酵母细胞表面展示技术概念 酵母细胞表面展示技术基本原理 酵母细胞表面展示技术常见系统 酵母细胞表面展示技术的特点
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酵母细胞表面展示技术的概述
• 酵母细胞表面展示技术(Surface Display)是一种真核蛋白表达系统。
它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点，在医 药、食品、生物燃料等多个工业领域都 有广泛的应用前景。
制备酵母菌表面展示样品
制备酵母菌表面展示样品酵母菌表面展示样品的制备方法可以通过以下步骤进行实施：步骤一：酵母菌培养和预处理1.1选择适当的酵母菌菌株，如Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）或Pichia pastoris（牧酒酵母）。
1.2在适当选择的培养基中培养酵母菌，以期获得高密度的酵母细胞。
此步骤中需要注意培养时间和培养基条件的选择。
1.3在合适的菌液浓度下收获酵母细胞，可通过离心或过滤等方式进行。
步骤二：选择目标蛋白和构建表达载体2.1根据需求选择适当的目标蛋白，并确定其表达所需的信号肽和连接序列。
2.2将目标蛋白的编码序列克隆到表达载体中，并进行双酶切鉴定以确保正确的插入。
步骤三：转化表达载体到酵母菌细胞并进行选择筛选3.1将构建好的表达载体转化到酵母细胞中，可以使用化学法、电转法或基因枪等方法进行。
3.2将转化后的酵母菌细胞接种在选择性培养基中进行培养，筛选出成功表达目标蛋白的阳性克隆。
3.3通过PCR、Western blot等技术进行阳性克隆的鉴定。
步骤四：酵母菌表面展示样品的净化和纯化4.1收获酵母菌细胞并洗涤，去除培养基和其它杂质。
4.2使用适当的方法（如裂解酵母细胞壁、溶解酵母细胞膜）将蛋白释放到溶液中。
4.3将溶液进行离心或过滤等操作，去除残留的细胞壁、细胞膜等。
4.4使用适当的纯化方法（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等）纯化目标蛋白。
步骤五：酵母菌表面展示样品的检测和鉴定5.1使用SDS-PAGE或其它方法检测纯化后的蛋白样品。
5.2通过Western blot、ELISA等技术鉴定纯化后的蛋白样品的免疫活性。
5.3可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等技术检测酵母细胞表面展示的蛋白。
步骤六：酵母菌表面展示样品的应用6.1根据需求可以将制备好的酵母菌表面展示样品应用于不同的研究领域，如抗体筛选、抗原呈递、酶学研究等。
6.2可以使用表面展示的酵母菌细胞作为疫苗载体进行疫苗研究。
酵母表面展示技术及其应用
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
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二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
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a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
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四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
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二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
酵母细胞表面展示
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最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达
是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列(含GPI锚 定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游,融合蛋白 诱导表达后,信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌, 由于融 合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列 ,可 将蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将蛋白分子展示表达在 酵母细胞表面。
随之发展起来的基于靶点的药物筛选至今已有大量成 功先例。
选择的靶点基本上可分为四种类型： 离子通道、核受体、G 蛋白偶联受体(GPCRs)和酶。
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离子通道
直接活性筛选 可通过酵母系统直接进行化合物活性筛选，这主要源于两种情况: (1)在离子转运缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生补充 生长的表型； (2)在酵母中表达离子通道蛋白可导致酵母生长缺陷。 在筛选离子通道抑制剂时，前种情况可筛选那些导致酵母生长 受抑的化合物，而后种情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长 的化合物。
大
融合蛋白 分子数量
多
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酵母表面展示系统的应用
酒精发酵
酵母表面展示
生物吸附 高通量筛选
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乙醇发酵
为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步 进行，莫春玲等通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将 来自丝状真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤 维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的 β-葡糖 苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达 3 种纤维素酶的酵母菌群 系统。
[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT
![[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/5af84c69c850ad02de804179.png)
丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒
• 主要外壳蛋白PVIII和4种次要外壳蛋白PIII、PVI、 PIX、PⅦ。PIII与PVIII蛋白一般主要用作展示外 源蛋白的锚定蛋白。 • PIII蛋白位于病毒颗粒的尾端，有3．5个拷贝，其 在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，其 功能是在噬菌体感染大肠杆菌时与F菌毛结合，使 噬菌体能吸附到细菌上。 • PIII蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋 白质的大小无严格限制，可用于生物大分子的表 达和功能分析等方面研究。PIII的拷贝数只有3．5 个，故可用于选择高亲和力的配体，但在免疫学 和生物疫苗研制中受到了限制。
酵母表面展示系统
• 酵母表面展示系统中研究较多的宿主主要 是酿酒酵母。
• ①酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其 基因的表达调控及蛋白质的翻译后加工、分泌机 制比较接近高等真核生物。可以表达多种不同大的展示 有独特的优越性； • ②酵母颗粒大，可利用流式细胞仪进行方便的筛 选和分离； • ③酵母展示的外源蛋白可紧密锚定在细胞壁上， 能耐受SDS的抽提； • ④酵母遗传学操作简单，具有发酵性，生长快， 并且安全无毒，可用于基因治疗及开发口服疫苗 等。
噬菌体展示技术的局限
性使噬菌体扩增中会不可避免地 造成20种氨基酸合成具有明显倾倾向性； • ④大肠杆菌的生物合成系统本身的局限性，不能 进行蛋白质的翻译后修饰； • ⑤展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影 响噬菌体的装配与感染。
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
酵母菌表面展示操作步骤概述
酵母菌表面展示操作步骤概述酵母菌表面展示是一种生物学研究和应用领域常用的技术，它通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，使其易于高效地表达、分离和纯化。
本文将对酵母菌表面展示的操作步骤进行概述，以帮助读者了解和掌握该技术。
步骤一：构建目标蛋白质基因的表达载体首先，需要将目标蛋白质的基因克隆到适当的酵母菌表达载体中。
常用的载体包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在构建载体时，应确保目标蛋白质的基因序列正确无误，并与载体正确连接。
步骤二：转化酵母菌将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化可以使用电穿孔法、乙醇法、锂酸法等多种方法进行。
转化后的酵母菌需要在适当的培养基上进行培养，以确保其正常生长和表达目标蛋白质。
步骤三：筛选表达蛋白质的阳性克隆经过一段时间的培养后，可以进行表达蛋白质阳性克隆的筛选。
一种常用的筛选方法是通过使用特定抗体或其他与目标蛋白质的结合能力相关的探针进行免疫检测或筛选。
步骤四：表达蛋白质的定性和定量分析对阳性克隆进行表达蛋白质的定性和定量分析，以确定其表达水平和活性。
常用的方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术等。
步骤五：优化表达条件根据定性和定量分析的结果，可以进行表达条件的优化。
优化表达条件包括培养基成分的调整、温度、pH值、诱导剂的浓度和诱导时间等因素的优化，以提高目标蛋白的表达效率和活性。
步骤六：表达蛋白质的分离和纯化经过优化的表达条件后，可以进行目标蛋白质的分离和纯化。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、为基础的层析等。
根据目标蛋白质的特性和需求，选择合适的纯化方法进行分离和纯化。
步骤七：确认目标蛋白质的展示效果经过分离和纯化后，需要确认目标蛋白质在酵母菌表面的展示效果。
常用的方法包括免疫荧光染色、流式细胞术等。
通过这些方法可以确定目标蛋白质是否成功地在酵母菌表面进行了展示。
总结：酵母菌表面展示是一种常用的生物学研究和应用技术，通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，以方便其高效表达、分离和纯化。
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示方法
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示方法表面展示方法是一种常用的酵母菌表达外源蛋白的技术，它通过将目标蛋白与表面展示蛋白基因融合，使其能够在酵母菌细胞表面显示。
表面展示方法可以应用于酵母菌工程、酵母菌表达系统、抗原表位验证等领域。
下面将介绍一种常用的酵母菌表面展示方法操作步骤。
步骤一：选择表面展示蛋白基因首先需要选择一个适合的表面展示蛋白基因。
常用的表面展示蛋白基因有AGA2、Aga1、Flo1等。
这些基因可与目标蛋白基因进行融合，在酵母菌细胞表面显示目标蛋白。
步骤二：构建融合蛋白基因在这一步中，需要将目标蛋白基因与表面展示蛋白基因进行融合。
可以通过PCR技术将两个基因进行连接，并在连接处添加合适的链接序列。
连接后的基因可以通过限制性内切酶等方法插入到表达载体中。
步骤三：将融合基因插入酵母菌将构建好的融合基因插入酵母菌表达载体中。
一般来说，可以利用特定的限制性内切酶进行酵母菌基因组中的特定位点插入。
插入后，利用酵母转化技术将表达载体导入酵母菌细胞内。
步骤四：酵母菌培养与筛选将转化后的酵母菌进行培养，以使其表达目标蛋白。
在培养过程中，可以利用选择性培养基选择表达目标蛋白的酵母菌。
例如，添加适量的抗生素，只有带有表达载体的酵母菌能够存活下来。
步骤五：检测与分析对表达目标蛋白的酵母菌进行检测与分析。
可以利用免疫学方法，例如Western blotting或ELISA等，检测蛋白的表达水平。
同时，也可以利用流式细胞术等技术，分析目标蛋白在酵母菌表面的展示情况。
需要注意的是，每个实验室、项目的具体操作步骤可能会有所不同。
因此，在实施表面展示方法之前，请务必查阅相关文献，了解相关实验操作细节，以确保实验的准确性和可靠性。
酵母菌表面展示方法是一种重要的生物技术手段，可以用于多种实际应用中。
通过掌握和运用这一技术，能够实现对目标蛋白的高效表达与展示，为相关研究提供有力工具。
希望本文能对您了解酵母菌表面展示方法有所帮助。
酵母菌表面展示操作步骤
酵母菌表面展示操作步骤酵母菌表面展示是一种常用的实验方法，用于确定酵母菌表面蛋白的存在和定位。
下面是酵母菌表面展示的详细操作步骤：1. 构建表达载体：选择合适的表达载体，如pYX212或pYX213，并将目标基因插入到载体中。
确保插入的基因含有适当的启动子和终止子，以确保目标基因在酵母菌中得到适当的表达。
2. 转化酵母菌：将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
可以使用化学法或电转法进行转化。
确保转化后的酵母菌具有抗性标记，以便筛选出转化成功的菌株。
3. 筛选菌株：将转化后的酵母菌接种到含有适当选择性培养基的平板上，并在适当的温度下培养。
筛选出具有抗性标记的菌株，表示转化成功。
4. 培养酵母菌：将筛选出的菌株接种到液体培养基中，并在适当的温度下摇床培养。
确保菌株在适宜的培养条件下生长。
5. 表达目标蛋白：在适当的培养时间和条件下，使菌株表达目标蛋白。
可以通过添加适当的诱导剂或调整培养条件来促进目标蛋白的表达。
6. 收集酵母菌：在目标蛋白表达达到一定水平后，收集酵母菌细胞。
可以通过离心或滤纸吸附的方式进行收集。
7. 处理酵母菌：对收集到的酵母菌进行适当的处理，如洗涤、裂解或固定。
这些处理步骤有助于提取和固定目标蛋白。
8. 免疫染色：使用适当的抗体对目标蛋白进行免疫染色。
可以使用一抗和二抗的组合来增强染色效果。
9. 观察和分析：使用显微镜观察染色后的酵母菌样品，并进行图像分析。
可以通过比较不同菌株或不同处理条件下的染色结果，来确定目标蛋白的存在和定位。
需要注意的是，酵母菌表面展示的具体步骤可能会因实验目的、酵母菌菌株和表达载体的选择等因素而有所不同。
在进行实验前，应详细阅读相关文献并根据实际情况进行优化和调整。
细菌与酵母表面展示技术教学材料
综上所述，细菌表面展示系统灵活多 样，操作简便，在多个领域显示出广 泛的应用前景，随着新的载体系统的 发展和其自身的不断完善，细菌表面 展示技术必将在实践中发挥更大的作 用。
2022/4/2
原理
• 酵母细胞表面展示技 术是近年来发展较快 的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是 将外源靶蛋白基因(外源蛋白) 与特定的载体 基因序列融合后导入酵母细胞， 利用酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白 固定化表达在酵母细胞表面。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛 选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的 的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质 是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取 ，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上 具有很好的应用前景。
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• 前景： • 表面展示技术日新月异，酵母展示系统在不断的完善和改
α-半乳糖苷酶被高效分泌入培
养介质，而αGal-ACI融合蛋白
主要与细胞有关。
2.α-凝集素-目的蛋白表面展示系统
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这是一种将目的蛋白作为C端与α-凝集素
Aga2p亚基的N端融合的表面展示系统。α-凝集素通过
与α-凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。
2022/4/2
天然α-凝集素结合活性部位 在Aga2p的C端，因此，此处代 表了一个细胞外大分子的可及 性区域和展示固定蛋白质的有 用位点。
酵母有两种交配类型MATa和 MATa的单倍体细胞，这两种细 胞之间的相互交配融合是通过 细胞表达α-凝集素和α-凝集素的 相互作用介导的。
• 目前，酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白质分 子的相互识别、定向进化以及新型疫苗的研制等 发面。①蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统 用于蛋白质亲和力和稳定性的定型进化已有成功 报道，最先被用于抗体的亲和力成熟;②活的口服 疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体， 因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展 示在细胞表面时，也具有免疫原型。因而可通过 在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。
酵母菌表面展示操作步骤
酵母菌表面展示操作步骤引言酵母菌表面展示是一种重要的生物学技术，通过将目标蛋白在酵母菌细胞表面展示，实现对其功能和结构的研究。
这一技术在生物医药、生物工程和生物能源等领域具有广泛的应用前景。
酵母菌表面展示操作步骤的重要性主要体现在以下几个方面：功能研究：通过酵母菌表面展示技术，可以研究目标蛋白在细胞表面的功能和相互作用，为疾病治疗、药物研发和基因工程提供重要的参考。
结构研究：利用酵母菌表面展示技术，可以通过结构分析方法研究目标蛋白的三维结构，揭示其分子机制和功能特性。
应用开发：酵母菌表面展示技术可以用于筛选和优化药物候选物、酶催化剂和抗体等生物活性分子，促进新药开发和生物工程领域的创新。
酵母菌表面展示操作步骤的内容包括以下几个关键步骤：基因克隆：将目标蛋白的基因序列克隆到酵母菌表面展示载体中。
转化：将克隆好的表面展示载体导入到酵母菌细胞内部，使其表达目标蛋白。
诱导表达：通过添加特定的诱导剂，促使目标蛋白在酵母菌表面得到表达。
表面展示：通过酵母菌表面展示系统，将目标蛋白定向展示在细胞表面。
检测和鉴定：利用适当的检测方法和技术，验证目标蛋白在酵母菌表面的展示效果，并鉴定其活性和结构特性。
酵母菌表面展示操作步骤的准确执行对于研究和应用该技术具有重要意义，可以为相关领域的科学家和工程师提供有力的实验方法和指导。
酵母菌株基因表达载体培养基在进行酵母菌表面展示实验之前，需要准备以下材料：酵母菌株：选择适合表面展示的酵母菌株作为实验材料。
常用的酵母菌株有Saccharomyces cerevisiae。
基因表达载体：用于将目标蛋白表达在酵母菌表面的载体。
选择适合表达需展示蛋白的载体，常用的载体有pYEX、pYES2等。
培养基：提供适合酵母菌生长的培养基，包括固体培养基和液体培养基。
常用的培养基有YPDA、SD等。
以上为进行酵母菌表面展示实验所需的材料清单，确保材料准备齐全后即可开始实验。
首先，选择合适的酵母菌株。
酵母菌表面展示的操作步骤
酵母菌表面展示的操作步骤酵母菌表面展示的操作步骤：酵母菌表面展示技术是一种基因工程技术，用于在酵母菌表面显示外源蛋白。
这项技术具有广泛的应用前景，可以用于疫苗研发、抗原表位筛选、酶工程等领域。
以下是酵母菌表面展示的一般操作步骤：1. 制备酵母菌工作库：首先，选择适合表面展示的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae或Pichia pastoris等。
然后，将目标蛋白的编码序列与酵母菌表面展示载体进行连接，得到重组质粒。
将重组质粒导入酵母菌细胞中，经过适当的培养和筛选，得到酵母菌工作库。
2. 构建表面展示的载体：将目标蛋白的编码序列与表面展示载体连接，通常采用DNA重组技术，将目标蛋白编码序列与表面展示载体的启动子、终止子以及分泌信号序列等序列连接起来。
确保连接正确无误后，得到表面展示载体。
3. 将表面展示载体转化入酵母细胞：将表面展示载体导入酵母细胞，可以采用化学法转化或者电击法转化。
在转化过程中，需要添加适当的选择性培养基，筛选转化成功的酵母菌克隆。
4. 诱导表面展示蛋白的表达：将转化成功的酵母菌接种至培养基中，培养一定时间，使酵母菌开始生长。
在适当的时间点，添加诱导剂，如酒石酸或甘油等，刺激酵母菌产生表面展示蛋白。
5. 检测表面展示蛋白的表达：采用免疫学检测方法，如免疫印迹、免疫荧光等，检测表面展示蛋白的表达情况。
可以使用特异性抗体来识别表面展示蛋白，并观察其在酵母菌表面的分布情况。
6. 验证表面展示蛋白的功能：针对表面展示蛋白的功能特性，进行相应的活性鉴定实验。
例如，对于展示的酶类蛋白，可以进行酶活测定；对于展示的抗原蛋白，可以进行抗原性测试。
总结：酵母菌表面展示技术是一种重要的基因工程技术，通过将外源蛋白表面展示在酵母菌细胞上，实现了对蛋白的高效表达和功能验证。
通过以上的操作步骤，可以成功制备出表面展示蛋白的酵母菌工作库，并通过免疫学检测和功能验证来验证表面展示蛋白的表达和功能。
酵母表面展示技术PPT课件
2021/7/23
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酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞
酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛 应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。
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酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
2021/常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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酵母表面展示系统与新药筛选 将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关
酵母菌表面展示操作步骤详解
酵母菌表面展示操作步骤详解酵母菌表面展示是一种常用的生物学实验技术，在生物医学研究、蛋白质表达和酵母遗传工程领域广泛应用。
它通过将目标蛋白质或肽链与酵母菌表面蛋白结合，使其在酵母菌表面展示出来，方便研究人员进行后续的功能研究和免疫学筛选等。
下面将详细介绍酵母菌表面展示的操作步骤：1. 构建酵母表面展示载体：选择合适的载体是酵母表面展示实验的首要步骤。
常用的载体包括pYEX、pCTCON、pCTTEV和GFP等。
根据需要选择具有相应表达子和突变体的载体，或进行进一步定制化设计。
2. 转化酵母菌：将构建好的载体导入酵母菌中，使用双杂交法（yeast two-hybrid）或化学转化法等方法进行转化。
确保得到的菌落包含目标载体，并通过PCR或测序确认插入片段的正确性。
3. 培养和预处理：将转化后的酵母菌接种在富含复合碳源的选择性培养基中，培养过程中定期检测菌落的生长情况。
使用含有抗生素的培养基可以筛选出带有目标载体的酵母菌。
4. 诱导表达：根据实验需要，在酵母菌的生长阶段适当的时间点诱导目标蛋白的表达。
一般可以使用变温、添加特定诱导剂或调节培养基pH值等方法。
5. 收获菌液：在诱导表达后，通过离心和洗涤的方式收获酵母菌。
注意避免杂质的污染，保证获得纯净的菌体。
6. 洗涤和固定：将酵母菌通过洗涤去除附着在细胞表面的杂质，例如未结合的蛋白、培养基组分和细胞外DNA等。
可以使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行洗涤，多次重复以确保彻底清洗。
随后，使用适当的试剂固定酵母菌，例如4%的乙醛或细胞固定化学试剂。
7. 目标蛋白检测/筛选：通过免疫染色、荧光显微镜观察或流式细胞术等方法，监测和筛选出表达和展示目标蛋白的酵母菌。
根据实验要求使用相应的探针或抗体对目标蛋白进行特异性检测。
8. 功能研究：根据目标蛋白的特性和实验设计，可以进行一系列的功能研究。
例如，通过细胞表面与其他分子（蛋白、肽等）的相互作用来研究蛋白的功能、传递信号和相互作用网络。
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酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
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酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作
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酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞
酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛 应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。
用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
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酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。
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原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
酵母表面展示技术
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细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞 表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较 快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞 表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
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载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。