酵母表面展示技术ppt课件
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酵母表面展示技术
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细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞 表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较 快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞 表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
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原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
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7
絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作
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酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。
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载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。
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外源蛋白
酵母表面展示系统适合展示各种真核蛋白，包括酶、细 胞识别因子、受体、抗体、抗原等，被广泛地应用于蛋 白质工程、全细胞催化、生物转化、细胞吸附、分子识 别、生物治疗、信号转导、生物传感器和疫苗等领域。 外源蛋白与载体蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端 融合、插入融合。对某些外源蛋白，选择恰当的融合方 式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端 两种方式与其融合。研究表明抗 CD3ε单链抗体融合于 Aga2p 蛋白C末端时，其亲和力较天然蛋白降低 30～100 倍[5]，而融合于N末端时活性得以恢复。
用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
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6
酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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9
酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或 突变体库进行筛选，能发现与这些未知功能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
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3
Hale Waihona Puke Baidu
酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞
酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛 应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。
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细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞 表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较 快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞 表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
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原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
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絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作
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酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。
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载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。
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外源蛋白
酵母表面展示系统适合展示各种真核蛋白，包括酶、细 胞识别因子、受体、抗体、抗原等，被广泛地应用于蛋 白质工程、全细胞催化、生物转化、细胞吸附、分子识 别、生物治疗、信号转导、生物传感器和疫苗等领域。 外源蛋白与载体蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端 融合、插入融合。对某些外源蛋白，选择恰当的融合方 式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端 两种方式与其融合。研究表明抗 CD3ε单链抗体融合于 Aga2p 蛋白C末端时，其亲和力较天然蛋白降低 30～100 倍[5]，而融合于N末端时活性得以恢复。
用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
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酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或 突变体库进行筛选，能发现与这些未知功能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
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3
Hale Waihona Puke Baidu
酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞
酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛 应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。