液相色谱柱的选择与使用

溶于有机溶剂
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
分子量<2, 000
溶于四氢呋喃
样品
溶于水
非离子化 离子化
分子量>2, 000
溶于有机溶剂 溶于水
用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式
用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
不规则形
1.8µm 3.5µm 5µm 7µm
10µm
C-18柱的性能影响因素：表面积与孔径
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有 较强的保留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡 状态, 对于梯度淋洗尤为重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填 料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改 善峰形
6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5
7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0
10 Time (min)
待测物pKa+1.5以 的流动相pH
可保证方法的稳定
键合相-适用pH范围
StableBond, pH
1-8
1. 使用空间位阻大的硅烷 2. 未-封端
Eclipse XDB, pH
• 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.
保留值与pH的关系
pH变化： 0.2个pH(7.0~7.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.6~14.8分钟)
保留时间随pH 改变不明显
保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中)
保留时间
保留值与pH的关系
孔径 • 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å
C-18柱的性能影响因素：硅胶纯度
（以安捷伦柱为例）
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
液相色谱柱的选择与使用
液相色谱柱的选择与使用
目录 一、液相色谱柱的选择 1、 分离模式的选择 2、 C-18柱的性能影响因素 3、 保留值与pH的关系 二、液相色谱柱的安装 1 、液相色谱柱的结构 2、 色谱柱的安装 三、液相色谱柱的使用 1 、样品的前处理 2 、流动相的配制 3、 色谱柱的平衡 4、 流动相流速的选择 四、 分析条件调整的影响 五、液相色谱柱的维护
300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸
分子量虽小但 hydrodynamic
流速: 0.75 mL/min
O
volume(水动力学体积)较大的
温度: RT 检测器: UV 282 nm
CH3 CHO
H3C

高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形
PW 1/2
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
0.20
0.18
300SB-C18 (300Å)
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅
C-18柱的性能影响因素：柱尺寸
色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 (≤ 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
传统键合及封端技术
OH CH 3
+ OH Cl Si R
OH CH 3
OH
R = C8,C18e, tc.
CH 3
O Si R
+ OH CH 3
OH CH 3 O Si R
CH 3
CH 3 Cl Si CH 3
CH 3
(TMS)
CH 3
O Si R
OH CH 3 CH 3
O Si CH 3 CH 3 CH 3
用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱

正相色谱 20%
反相色谱 80%
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
封端 • 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键
合后封闭起来
C-18柱的性能影响因素：键合类型
CH3
键合类型对色谱分离的影响 ： O Si
单齿键合：
CH3
OSi
CH3
提高传质速率, 加快色谱柱平衡
O Si CH3
CH3
OSi
CH 3
双齿键合：
O Si
增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载
CH3 CH3
10 0
5
10
Time (min)
• 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径
• 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍
C-18柱的性能影响因素：色谱柱化学性质
键合类型 • 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率 • 与基体物质相连的键合相的量
7 4 2, 3 1
5
4 7
3
5 1
6
2
6
0
5 Time (min)
色谱柱: ZORBAX Extend-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH
pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11 缓冲液 20 mM TEA
流速: 1.0 mL/min
色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理
色谱柱
高压泵
检测器
色谱工作站
进样器
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组 成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关 键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
一、液相色谱柱的选择
1、分离模式的选择
溶于正己烷
OSi
样量
O Si CH3
CH 3 CH3
OSi
O Si
CH 3
C-18柱的性能影响因素：碳覆盖率
碳覆盖率--- 对色谱分离的影响
高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间
封端 --- 对色谱分离的影响
封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸 性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的 色谱柱在选择性上有明显差异
•碳覆盖率 •封端
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
C-18柱的性能影响因素：色谱柱物理性质
硅胶纯度 • 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸 • 填料床的长度和内径
颗粒形状 • 球型或不规则型
粒径 • 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积 • 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
中等pH下,分析酸性、碱性 和中性组分,可用于100%全 水相,尤其极性组分峰形优 异,柱寿命长
中~高pH下,分析酸性、碱 性和中性组分,尤其碱性组 分峰形优异, 柱寿命长
R
O Si
R OH
R
O Si
R OH
R
O Si R
样品 MW ≤ 4, 000, 选择 80Å 的孔径 样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
大孔径填料适用于大分子分析
大孔径300Å 全多孔色谱柱

可用于分离蛋白质和多肽

分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
CH2
分子
HO
O O CH2
H3C O
OCH3 OCH3 CH2 O
HOH3C N CH3
O O
OH
O CH3
O
HO
CH3 OH
CH3
SB-C3
CH3
Tylosin(泰乐菌素)
300SB-C3
(80Å)
MW. 926
(300Å)
Pw 1/2 = 0.442
Pw 1/2 =0.125
0
5
Time (min)
1
2
3
4
Time (min)
5
6
样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen
pH
12
45
67
7.25
3
0
1
2
3
4
5
6
Time (min)
O Si R
固定相键合 二甲基硅烷
封端 四甲基硅烷
3、保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax
StableBond C18
4.6 X 250mm, 5um
部件号：880975-906
流动相：27%甲醇：73%磷酸
pH 2.5 & 2.6
温度：500C
流速： 1.0mL/min.
Байду номын сангаасpH
RS
变
变
化
化
值
值
0.1
1.6
保留值与pH的关系
pH 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8
12
45
4.6 x 75 mm, 3.5 µm 流动相: 44% 25 mM磷酸,
pH 7.00 : 56% 甲醇
7.00
7
3
6
流速: 1.0 mL/min
温度: 25°C
0.25 个pH 0
检测: UV 250 nm
C-18柱的性能影响因素：颗粒形状与大小
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O 时, 球型颗粒可降低柱压, 延长色谱柱寿命
球形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
中性组份 酸性组份
碱性组份
保留值与pH的关系
Extend C18 pH 2~11.5
Bonus-RP pH 2~9
Eclipse XDB C18 pH 2~9 StableBond C18 pH 1~8
复杂组分的流动相pH选择技巧
Extend-C18 pH 7
高pH下,
碱性成分的保留增加
Extend-C18 pH 11
2-9
1. 致密键合的二甲基烷基硅烷 2. 专利技术双 - 封端
Bonus-RP, pH
2-9
1. 极性烷基固定相 2. 使用空间位阻大的硅烷 3. 三封端
Extend-C18, pH 2-
11.5
1. 独特的双齿键合结构 2. 双封端
低pH下, 分析酸性、碱 性和中性组分,峰形优 异, 柱寿命长
中等pH下, 分析酸性、碱 性和中性组分, 尤其碱性 组分峰形优异, 柱寿命长
0.16
SB-C18 (80Å)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
II)
00..00024LeMu.EWn. k=e5p5h6alinAnMgi.oWte. n=s1in04II6(血Ins管Mu紧.lWin张.B=素3,
496 CyMt C.W. = 12,
3R2n7Mas.We(.核=糖13核, 酸6酶L8y4)sMo.Wzy.m=e1(溶3,菌酶90)0
温度: RT 检测器: UV 254 nm
0
5
1. Maleate 马来酸盐
2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6
3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8
4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2
5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1
柱填料基质
高或低pH下, 硅胶会溶解 • 硅胶基质- pH 3~8
化学修饰困难 • Al2O3 . nH2O - pH1~14 孔结构复杂, 孔径不均匀，导 • 聚合物基质 - pH1~14
致柱效不够高, 有机溶剂可能 导致聚合物基质溶涨而受损
2、C-18柱的性能影响因素：
物理性质
化学性质
•键合类型
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A