电泳法

电泳法

朱莹分析化学S1*******

摘要：电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象，电泳不仅作为一种现象，而且作为一种技术方法得到不断发展。从界面分离到各种区带电泳，开辟了混合物的电泳分析的可能性。电泳不仅适用于蛋白质[1、2]、核酸[3]、糖[4]等生物大分子的分离分析，而且也能用于氨基酸[5]、手性药物[6]、维生素[7]、有机酸[8]的分离分析。毛细管电泳在分离机理和液相色谱之间有互补性，已越来越多地替代HPLC法用于有关物质的检测。本文详细介绍了电泳法的基本概念、分类及应用。

关键词：电泳、毛细管电泳、实际应用。

一、电泳法的基本原理

电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）[9]。

物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。

在两个平行电极上加一定的电压(V)，就会在电极中间产生电场强度(E)。

在稀溶液中，电场对带电分子的作用力(F)，等于所带净电荷与电场强度的乘积：

F=q·E

这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：

F’=6πrηυ

式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时：F = F’，

∴q·E = 6πrηυ

电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电分子的迁移速度：

所以，

m=υ/E=q/6πrη

这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。

由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，如：待分离生物大分子的性质、缓冲液的性质、电场强度、电渗、持介质的筛孔。

二、电泳法的分类

原则上按电泳的原理来分，现在有三种形式的电泳分离系统：即移动界面

电泳、区带电泳和稳态电泳或称置换（排代）电泳。

界面移动电泳可以确定带电物质的迁移率，并且能用来研究混合物的组成成分，但是它不能用来分离混合物，也不适用于研究低分子量的物质，主要用于蛋白质系统等生物大分子的研究方面。虽然它曾取得过很大的发展，但是由于设备复杂，操作时间很长，不能完全地分离混合物的各个组成等一些不可克服的缺点，已逐渐为区域电泳所代替，并从而发展为许多新的电泳法。

区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。但是支持介质有时会吸附不同分子或起分子筛作用（层析效应）而对分离起破坏或帮助作用。近50年来，固体支持介质可分为两类：一类如纸、醋酸纤维素薄膜等。它们是化学惰性的，能将对流减到最小。用这些介质分离主要是基于蛋白质的电荷密度。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。它们不仅能防止对流，把扩散减到最小，并且它们是多孔介质，孔径大小和生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效用[10]。

现国内外活化凝胶大多采用溴化氰法，但该法活化产生异脲键，易引起非特异行的吸附，在碱性环境中不稳定，且溴化氰毒性大，活化条件不易控制，活化时间超长可产生的有活性的氰酸酯迅速水解，导致偶联率下降而环氧氯丙烷法虽然鲜有人报道，但其毒性小，易操作，成烷胺键稳定性好，其带有的-CL 基团和环氧基团在活化时能使凝胶轻度交联,增加琼脂糖的强度[11] 80年代末发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳方法，又称毛细管区带电泳。它是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离，分离的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。

稳态电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到一个稳态。在稳态达到后，带的宽度不随时间而变化，等电聚焦和等速点用应该是属于这一类[12]。

下面介绍几种典型的电泳:

1、醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

醋酸纤维素薄膜分步电泳法不仅快速简便,检测灵敏度高(检出限0.1g/L) ,还可以进行定量分析,尤其可以同时检测多个样品,简便快速、成本消耗低,可以作为HP生产厂以及国家药检部门HP原料药质量控制的常规检测方法[13]。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

自从1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是60年代初Hjerten和Ornstein和Davis发表他们的不连续电泳系统的基础工作以来，聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验室最常用的支持介质。由于它的分子筛效应，提高了电泳分离率，不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，诸如电荷、分子量、等电点以至于构象。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,又称天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）。它是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构想、亚甲基之间的相互作用及其生物活性[14]，因而根据其电泳迁移率，可得到天然蛋白质的分子量[15,16]。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有以下三个优点：

1）可以在天然状态分离生物大分子；

2）可分析蛋白质和别的生物分子的混合物；

3）电泳分离后仍然保持生物活性。

使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质的分离，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。在连续缓冲系统中，主要取决于电荷密度；在不连续缓冲系统中，由于介质的分子筛效应，后二者有较

大影响，见图。