浙江大学生物化学丙实验报告1

专业：农业资源与环境

姓名：李佳怡 ____________

学号：_J6 _______________

日期： __________________ 地点：生物实验中心310课程名称：生物化学实验（丙）

实验名称：蔗糖酶的提取

一、实验目的和要求（必填）

三、实验材料与试剂（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填）

七、实验结果与分析（必填）

.指导老师：方祥年 成绩:_ _同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法;

2、 巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。

二、实验内容和原理

订 1、实验内容:

线 蔗糖酶的提取、分离纯化

2、实验原理:

① 酵母细胞破碎

液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法

固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶

本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀

来。

② 蔗糖酶的初步分离纯化

蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。

本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。

由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告

细

胞

破碎

的

常

用

方

法

三、实验材料与试剂

1、实验材料

市售干酵母粉10g/组（3〜4人）

2、实验试剂

石英砂，95%乙醇（-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。

四、实验器材与仪器

电子天平（称量干酵母粉）：研碎（每组一套）：50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）：高速冷冻离心机：恒温水浴箱（50°C）；量筒（50ml）、微量移液枪（lOOOu 1）及枪头或移液管（1ml）、玻棒、滴管等;离心管（留样品I、II用）及离心管架：制冰机：一20°C冰箱。

五、操作方法和实验步骤

1、酵母细胞破粹（干磨法）

①称量：称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵

②研磨（干磨）：至尽可能成细粉末状（约15min）

③加液+研磨：呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液，分2次加研磨lOmin,

使呈糊状液体；

④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后（托盘天平上），离心lOmin

（条件:4°C、12000r/min）

⑤收集+测量：收集上淸液并量出体积VI （样品I）,另留1ml上淸液（样品I ）放置一20°C冰箱保存

用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析

2、热处理

①水浴热处理：将上步抽提液（样品I）,迅速放入50°C恒温水浴，保温30min,

并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。

②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min

③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min a

（条件：4°C, 12000r/min）

④收集+测量：收集上淸液并量出体积V2 （样品II）,另留1ml上淸液（样品II ）放宜一20°C冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。

3、有机溶剂（乙醇）沉淀

①冰浴：将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，

放置约20min：

②离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心lOmin：

（条件:4°C, 12000r/min）

③收集保存：弃去上淸液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解沉淀

留岀lmL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管，一20°C冰箱保存。

（用于实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶）

六、实验数据记录和处理

1、实验数据记录

石英砂：：

干酵母粉:；

Tris-HCl提取离心后上淸液体积（样品I ）VI：：

样品I热处理离心后上层淸液体积（样品II）V2：。

2、实验现象：

研磨过程：干酵母颜色变浅，散发岀一股难闻的气味：

第一次离心后：上清液澄淸颜色上黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色，

下层石英砂呈白色：

第二次离心后：上清液更加澄淸橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅：

第三次离心前：上晴液柠檬黄，沉淀为米白色。

七、实验结果分析讨论

1、实验结果：

①经过研磨破碎的酵母提取液样品I （lmL）：

②将样品I经过热处理的样品II （lmL）：

③经过选择性变形和有机溶剂沉淀处理过的样品II,用Tris-HCl缓冲液溶解保存在一只7mL和一只lmL的离心管中（样品III、IV）。

注意：所有收集样品均需在管壁外用油性记号笔做好标记，先放在一次性PE手套中，并放入-20 *C冰箱中保存，用于后续实验。

2、结果分析：

①最后得到的两管沉淀，英中一管为米白色沉淀，另一管夹杂部分黄色沉淀，疑为杂质蛋白，或是由于在加入乙醇时体积比例没有调整好而造成，具体结果有待进一步检测。

②误差分析: