全长cDNA的获得_RACE及其他方法进展
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
获得真核生物cDNA全长
获得真核生物cDNA全长★miRNA(金币+1):请按照版规发贴！！！以后不要求一律清除，请修改！【资源】获得真核生物cDNA全长1．获得真核生物cdna全长总的思路分离基因一般就从中心法则dna、rna、蛋白质的三个层次入手做工作。
随生物信息学的发展，电脑克隆基因也称为新兴的技术。
从题目获得全长cdna的要求上讲，即使上述几个途径得到的是基因片断，现有的途径也是可以完成cdna 全长的获得的（如下图示）。
因此，cdna全长的获得是技术上可以解决的问题，而目的基因的寻找，特别是未知功能的基因的克隆是比较关键的问题，下面就基因克隆的方法做一简要介绍：2．基因克隆的方法简介2-1．基因克隆的方法策略选择原则从表3中可见分离克隆基因基本上有三种类型：即三中不同的条件，可根据欲克隆的目的基因选择条件选择相应的方法。
类型i已知基因的序列（1）已知dna序列，包括三种情况，一是已知目的基因的dna全部或部分dna序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的dna序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cdna全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。
（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。
在这两种情况下一般采用pcr技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。
类型ii已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、t-dna标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。
类型iii为止目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。
可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和ddrt-pcr、ssh-pcr、rap-pcr、dna-rda、cdna捕捉法等进行克隆。
（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。
从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。
由EST到全长cDNA—RACE及相关技术进展
（第 三 军 医 大 学 全 军 复 合 伤 研 究 所 ， 庆 ４ ０ ３ ） 重 ００ ８
摘 要 ：由 Ｅ Ｔ 出发 获得 仝长 ｃ ＮＡ是 基 因组和功 能基 因 组研 究 的重 要 内容 之 一，ＤＮ Ｓ Ｄ ｃ Ａ末 端 快 速 扩 增技 术 （ Ａ Ｅ） 实现 此 目的 的 重 要 方 法。 本 文 对 Ｉ￣ Ｅ的 基本 原 理 及 其 改进 ， 其 是 Ａ —ＭＶ Ｒ Ｃ 是 Ｌ． Ｃ 尤 Ｍ 酶 ａ （ｅ ｐａ ｗ ｔ ） 能 的应用 带来 的技 术 革 新进 行 了综述 。 Ｓ ｔｍ ｌｔ ｓ ｉ ｈ 功 ｅ ｃ
ｅ １ ９ ２ ０ ５ ３ ）：６ ＿ ４ ０ ．９ ５．７ （ ２ ５ ４ ７ ＿ ７
［ ］ Ａ ｍ Ｖ ｕ ｅ ． ｃ ｓ ｅ ２ ０ ，８ １ ） Ｅ ６ ２ Ｎ ｄ ｉ Ａ ｉ ｓ ０ ０ ２ （ ２ ： ６ ｚ ｄＲ ［ ］ 朱 滨 等 生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展 ，０ １ ２ （ ） ３ ２０ ，８ １ ：
关键 词 ： 达序 列标 签 ； 表 奎长 ｅ Ａ；ＤＮ ＤＮ ｅ Ａ末 端 快 速 扩 增 中 围分 类号 ： ５ Ｑ ５ Ｑ ２； ７
利 用 表 达 序 列 标 签 （ ｘ ｒｓｅ ｅｅ ｃ ｅｐｅｓｄ ｓｑ ｎｅ ｔ ，Ｓ ） ａ Ｅ Ｔ 不但 可 以对 基 因进 行染 色 体定 位 ， ｇ 而 且 通 过 比较 不 同 研 究 条 件 下 的 Ｅ Ｔ 表 达 Ｓ 情 况 ， 获得 丰 富 的 生 物 学 信 息 。但 绝 大 多 可 数 Ｅ Ｔ分 布 在 基 因 的 ３端 ， 据 库 中 代 表 基 Ｓ 数 因 ５端上游信息 的 Ｅ Ｔ只 占很小 的 比例 ， Ｓ 而 且 Ｅ Ｔ的长 度 都 在 ３ ０～５ ０ ｐ 间 ， 从 Ｓ ０ ０ ｂ之 仅
RACE原理及其应用
RACE 的简介目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA 很困难。
近年来发展成熟的cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术，成为克隆全长 cDNA 序列的常用手段。
第二 RACE 的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’ 末端，是一种简便而有效的方法，又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。
3’RACE 的原理一)加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到(-)cDNA；二)以 oligo(dT)l7 和一个 35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。
扩增的特异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
cDNA末端快速扩增技术的研究进展_邬珺超
当 mRNA 数量不多或所得的组织为有限量的时 候克隆全长 cDNA 就 成为一项艰巨的工作 。 通常 , 一个序列很容易加到 5' 末端作为反转录的引物 , 与 特异引物或带有 poly(dT)尾的寡聚核苷酸配合 , 利 用大多数 mRNA 3' 末端的 poly(A)序列进行扩增[ 3] 。 也可以设计在 cDNA 3' 末端加上已知的序列 。 许多 人都考虑到用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)进 行 dG 或 dA 的加尾 , 但是这一方法有着很大的局限 性 。首先 , TdT 的反 应很难 控制而 且效率 比较低 。 其次 , 作为合成第二链的引物包含一个同聚(dC 或 dT)尾 , 会产生非特异性扩增 , 这一情况降低了低丰 度 mRNA 的分离效率 。 要避免这些缺陷 , 有些人用 双链 cDNA , 是在其两端连接上合断的 cDNA[ 9] 。
timum carbamide concentration (0 .1g/ L)as an organic nitrogen source could enhance the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content .When carbamide concentration was over 0 .2g/ L , S .platensis grew slowly , and even died beyond 0 .4g/ L .It was also found that both the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content were affected by sodium chloride concentration .When sodium chloride concentration was 0 %or 2 .0 %, S .platensis grew as the control (0 . 2 %), but the phycobiliprotein content was higher than the control .S .platensis grew slowly when sodium chloride concentration was over 4 .0 %, and even died after 3 days over 6 .0 %.
cDNA末端快速扩增技术RACE
原理图
伸等方法来保证mRMA 5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。
阳性对照RACE PCR实验
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
◇ Tota（l R3N）A无降解，OD260/280=1.
poly(C)替代poly(A)
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
碱基互补 配对原则
AT之间 形成两个氢键
GC之间 形成三个氢键
poly(C)替代poly(A) 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性
增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
cDNA第一链的合成机制
SMARTer RACE流程
基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
GSP1：5’-RACE PCR的反义引物 GSP2：3’-RACE PCR的正义引物
注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似
GSP 与 cDNA 模板的关系
NGSP：槽式（Nested）PCR引物
扩增后的预期：
利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 目的序列的5′端和 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 cDNA第一链的合成机制 ◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 目的序列的5′端和 cDNA第一链的合成机制 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1. NGSP：槽式（Nested）PCR引物 基本RACE 原理和方法
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术的原理和操作
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
RACE(rapid-amplification_of_cDNA_ends)
RACE技术的简介RACE技术的简介cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点:与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室常用的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28 bp50－70％ GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2)。
由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
注意事项：1、cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
2、RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
3、在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
4、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
5、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折。
race法获得全长cdna序列的过程
race法获得全长cdna序列的过程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
cDNA获取方法
索取条款本着科研工作者之间互通有无的原则，非营利性质的研究机构的科研人员可向本实验室索取我们收集的人类全长cDNA，请在索要cDNA前，详细阅读本索取条款。
1.索取人不得将cDNA转让于第三方或用于商业用途。
2.按照本实验室提供的方法，索取人可以使用PCR方法方便快速地克隆相应基因，但我们不能保证所提供的cDNA一定能够满足索取人的实验要求，不过我们欢迎索取人的反馈。
3.本实验室收集的cDNA数量众多，信息繁杂，不便查询，无法提供除cDNA序列以外的任何信息，请勿询问。
4.本实验室对提供cDNA不收取任何费用，请索取人自付邮资（邮资到付）。
此外，因本实验室人力有限，索取的样品一般情况下不能多于10个/次，如有特殊需求，可以直接跟我们联系协调。
本实验室每周寄出一至两次样品，在寄出样品后，我们会邮件通知。
本校实验室凭打印的邮件直接来本实验室领取。
5.通过该网站仅能索取我们收集的cDNA，如需要我们发表的文章中所用到的质粒，请另外来信索取。
6.请严格按该方法通过PCR来扩增cDNA，否则可能将无法得到需要的cDNA。
cDNA获取方法本实验室提供的cDNA样品为100 μL含抗生素的菌液。
收到菌液后，请先确认菌液是否浑浊，若菌液澄清，请先在37度摇床上过夜培养后再使用。
另外，由于我们在建库时，每管中可能含有不只一种cDNA，因此不推荐将菌液在平板上划线后挑取单克隆进行扩增。
根据我们的测试，使用此方法获取目的cDNA的概率达95%以上。
具体方法如下：1.取1 μL菌液为模板，PCR扩增全长cDNA。
我们网站上的核酸序列为cDNA的实际序列，因此设计引物时，请严格按照我们提供的序列设计引物。
PCR体系一定要有去污剂（如，Triton X-100），我们推荐的PCR体系如下：菌液模板 1 μL10× PCR buffer 5 μL10 mM dNTP mix 1 μL10 μM Forward Primer 1 μL10 μM Reverse Primer 1 μLTaq 2.5 UH2O 至总体积50 μL提示：1)实际上，很多（但不是全部）商业化的高保真酶同样可以用来扩增该cDNA，但是必须确保反应的体系中含有去污剂。
RACE的技术原理和操作
RACE的技术原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种用于扩增cDNA末端的技术，主要用于确定基因的结构和转录起始位点。
RACE技术的关键步骤包括cDNA合成、RNA末端修饰、RACE PCR、校正反应和测序。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
首先，RACE技术需要提取待研究的组织或细胞中的总RNA，使用反转录酶通过逆转录反应合成第一链cDNA。
反转录反应的关键是引入适配器序列（adaptor sequence）到cDNA末端，这样可以提供引物（primer）结合的位点。
接下来，使用指定酶（比如TdT）对合成的cDNA末端进行修饰。
修饰反应通常使用非模板化的端粒酶，这样可以在cDNA的3'末端添加poly-A尾。
添加poly-A尾的目的是为了提高引物的亲和性和特异性，同时也是为了提高RT-PCR的反应效率。
然后，在修饰的cDNA末端使用逆转录引物（gene-specific primer，GSP）和转录启动座位引物（TSP）进行PCR扩增。
逆转录引物是根据已知基因序列的3'末端设计的，它与cDNA的修饰末端具有互补性。
转录启动座位引物是根据已知基因序列的5'末端设计的，它也与cDNA的修饰末端具有互补性。
PCR反应的条件和步骤与常规PCR相似，但使用了增长温度梯度，以优化反应条件。
PCR反应通常包括初步扩增和内部扩增。
初步扩增通过扩增初始cDNA的末端，避免其它非特异性产物的扩增。
内部扩增是针对初步扩增产物进行的，目的是获得特异性较强的产品。
在内部扩增中，逆转录引物和转录启动座位引物的使用与初步扩增相同。
完成PCR反应后，需要验证PCR产物的特异性。
通常，可以通过凝胶电泳分析PCR产物来确定其大小和特异性。
如果PCR产物存在多个带或杂带，可能需要优化PCR反应的条件。
对于RACE技术最关键的一步是校正反应（nested PCR）。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的c DNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。
病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5 '端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落P CR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。
扩增基因全长实验技术
测序
PCR扩增
生物信息学分析
Ⅰ电泳检测 Ⅱ凝胶回收 Ⅲ电泳检测 Ⅳ克隆
PCR产物测序 凝胶回收测序 克隆后菌液测序 克隆后质粒测序
基因全长获取
RACE 简介 试剂盒 选取
5’RACE
原理 实验 过程
方法
RACE技术
RACE 简介
cDNA末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序 列来获得完整cDNA序列的一种方法。 分为3’RACE 和5’RACE
家族成员多重比对pcr扩增凝胶回收测序?设计引物?提取rna?反转录?pcr扩增电泳检测凝胶回收电泳检测克隆?pcr产物测序?凝胶回收测序?克隆后菌液测序?克隆后质粒测序基因初步验证race技术方法race简介试剂盒选取5race原理实验过程基因全长获取cdna末端快速扩增rapidamplificationofcdnaendsrace技术是基于pcr技术由已知的部分cdna序序列来获得完整cdna序列的一种方法
获取基因全长基本流程
以本实验室具体情况为例子
构建数据库
库
筛选EST序列
普通PCR进行初步验证 RACE技术
筛选EST 基因初步验证
获取基因全长
进行全序列分析
生物信息学分析
基因初步验证
1. Blast比对 2. ORF比对 3. 相似序列 多重比对 4. 家族成员 多重比对 •设计引物 •提取RNA •反转录 •PCR扩增
实验 过程
RACE PCR
每50ul的体系中先合成41.5ul的Master Mix: 34.5ul 5.0ul 1.0ul 1.0ul PCR-Grade Water HiFi PCR Buffer dNTP HiFi Mix
RACE原理及实验步骤
的结合所带来的影响；
2
在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）
采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶
3
或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效
地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的
mRNA 二级结构对逆转录的影响；
采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落
SMARTTM 5'-RACE 的原理
5’ RACE流程图
五、cDNA 末端的快速扩增(RACE)
主要步骤：
1、PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的 PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5'- 和 3'RACE 反应。 对于50-µl PCR 反应，所混合的成份如下：
2、漩涡混合（不要产生气泡），短暂离心。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位 的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切 酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含 量。
一、成分及另备物品
保存条件： 1. Control Human PlacentalTotal RNA
和 BD SMART II A Oligonucleotide在– 70°C下保存。 2. NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下 保存。 3. 其余试剂–20°C下保存。
(Cat.Nos.639206/639207) Advantage 2 Polymerase Mix
RACE原理及实验步骤
RACE原理及实验步骤RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和克隆未知DNA序列的两端。
通过RACE技术，研究人员可以对未知基因的序列进行扩增和鉴定，从而了解该基因的结构和功能。
RACE技术主要包含两个步骤：首先是逆转录，将RNA转录为cDNA，然后是扩增，利用特定的引物扩增未知序列。
下面将详细介绍RACE技术的步骤和操作方法。
实验步骤：1.RNA提取：首先需要从组织或细胞中提取RNA。
可以使用常见的RNA提取试剂盒，按照厂家提供的操作指南进行操作。
2.逆转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
逆转录可以选择两种方法：随机引物逆转录和基因特异引物逆转录。
-随机引物逆转录：在反应体系中添加随机引物，以确保逆转录反应能逆转录所有RNA分子。
将RNA与随机引物一起孵育，使得引物能够与RNA序列互相结合，并成为逆转录反应的起始点。
逆转录反应通常在37-42°C进行，持续1-2小时。
-基因特异引物逆转录：如果已知目标基因的部分序列，可以使用基因特异引物逆转录。
在逆转录反应系统中添加特异引物，使其与目标基因序列互补结合。
该方法提高了逆转录的特异性，从而只逆转录目标基因。
3.RACE扩增：使用扩增反应将目标序列扩增出来。
扩增过程通常使用PCR技术。
-5'RACE：首先进行5'RACE，即扩增未知基因序列的5'端。
为了扩增未知基因的5'端，需要将cDNA的3'端进行特定的修饰，以便进行扩增。
修饰通常包括尾修饰和连接转录片段引物。
然后使用尾修饰的cDNA和一个基因特异引物进行PCR扩增。
PCR反应条件根据实际情况进行优化，反应体系中应包括模板cDNA、引物、dNTPs和热稳定DNA聚合酶等。
- 3' RACE：进行3' RACE，即扩增未知序列的3'端。
在逆转录反应中添加一段poly(A)尾修饰，将逆转录产物转录为cDNA。