westernblot详细图解详细版.docx
医学Western blot(细胞蛋白)
Western blot （细胞蛋白）1.取细胞：若细胞为贴壁细胞，先将细胞用胰酶消化下来（至L5ml EP管）；若为悬浮细胞，可直接抽取一部分细胞至EP管，离心（我们实验室小离心机4500rpm, 5min,具体可调节），去上清。
2.洗：加ImlPBS充分混匀，离心（同上，具体可调节），去上清。
3.裂解：加 80T20ul 裂解液（RIPA:PMSF： COCK TAIL=100:1:1）,充分混匀，冰上裂解30mino4.离：12000rmp,4℃, 10min o将上清转移至另一 L5ml EP 管。
5.定量（BCA法）6.加蛋白上样缓冲液（5X）,即步骤三所加裂解液的量4二所加蛋白上样缓冲液的量。
充分混匀。
7.沸水煮lOmin,取出冷却4℃,可放-20℃保存。
8.配胶：先配下层胶，按需求选择板子（1.0或1.5）,配完立即加无水乙醇等待30min凝（天冷时间可延长）。
上层胶，配完立即插梳子等20-30min （天冷时间可延长）。
9.加样第一孔加marker （3. 5-4ul）第二孔以后加样品，最后一个可再加marker（1.5-2. OuD&B：在电泳液中加样；电压80V. 30min,等到在压缩胶的作用下，处于同一水平线或看到marker红蓝分离，可调电压至120v （40-50min）0电泳液是IX SDSo10.切胶根据因子分子量（可扩大切胶范围，以防出现误差）11.转膜海绵用遇冷的转膜液浸湿，PDF膜用甲醇激活lmin.放置顺序海绵-膜-胶-海绵-电极板,注：赶气泡,然后通电12.封闭5%脱脂奶粉（比如称0. 5g奶粉，取10ml IX TBST） 2h.然后IX TBST洗13.孵育一抗，摇30min-lh后放4℃冰箱过夜。
14.回收一抗，IX TBST洗膜，洗3次，lOmin/次，转速130左右15.孵育二抗2h 2ml左右（转速70）16.回收二抗TBST洗膜，洗3次，10min/次17.显影（1:1）,每个膜2001d左右。
Western_Blot详解及问题分析课件
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
Western Blot
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法
太高。转膜过程注意降温
Western Blot
转移到膜上的蛋白很少
原
1. 蛋白因分子量< 10KD
2. 蛋白的等电点< 9
对
3. SDS浓度不合适
策
4. 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜
2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入
0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
1M Tris-HCl(pH6.8)
1M DTT SDS
甘油 溴酚蓝 总体积
10 ml
20 ml 4g
20 ml 0.2 g 100ml
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
工作浓度
Western Blot
杂交信号很弱
原 1. 抗体保因存不当
2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃
，使用前做效价检测
对 2. 增加蛋白上样量，做已知
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步调及问题解答)之樊仲川亿创作Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产品，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步调五、一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采取的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识表记标帜的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能坚持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标识表记标帜的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现经常使用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操纵也比较简单，原理如下（二抗用HRP标识表记标帜）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保管。
严格核实PH不得超出7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超出两个月，隔几个月须重新配制。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
westernblot详细图解
Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS—PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验.2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）1。
0 ml；10％SDS 6.0 ml；β—巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3。
转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g；Tris 5。
8 g；SDS 0。
37 g；甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。
4。
0。
01 M PBS(pH7。
4)：NaCl 8。
0 g；KCl 0。
2 g；Na2HPO4 1。
44 g；KH2PO4 0。
24 g；加ddH2O至1000 ml.5。
膜染色液：考马斯亮兰0。
2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5％脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1。
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
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上样缓冲液 Loading buffer
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一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
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3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
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3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
(完整word版)WesternBlot结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析Q1。
啥也没有［原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片,最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的。
[解决办法］：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题.[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有,如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低,ECL发光液失效.另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片.Q2。
高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够［解决办法]：降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数.[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免,洗膜按照规定来5min*5次或者10min＊3次,不要改成5min*3次，或者10min＊2次。
Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]:更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合.Q4. 条带中出现边缘规则的白圈［原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验］：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵.注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
Western blot胶的制备——凝胶标志图解
Western blot胶的制备——凝胶标志图解
初次涉及该实验，往往不知道胶什么时候就凝好了，有什么样的标志？现将该过程，图解如下：
分离胶凝胶前
分离胶凝胶后标志：有明显的“界面”，该过程约20-30min。
分离胶凝胶后，竖立放置胶架，倒出酒精，并用滤纸吸干。
加入浓缩胶，并插入梳子
下图为完好的梳子和一侧小齿断掉的梳子
浓缩胶凝胶前凝胶后
浓缩胶凝胶标志：胶体回缩与梳子明显分离，该过程约40-60min。
以下是梳子两侧小齿完好与否，浓缩胶凝胶后的差别。
浓缩胶凝胶前 凝胶后
浓缩胶凝胶前 凝胶后
可以看到一侧没有小齿的梳子，会导致浓缩胶最外侧的胶体过分回缩，导致泳道无法使用。
因此，制胶时的操作过程中，要有意识地保护梳子两侧的小齿不被损坏。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备 聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合 而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为 中性、水溶性、三维网 状结构。 不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高 浓度胶分离。
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分 钟， 否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色， 丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法： 将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
Western-Blot过程步骤详解中英文对照
Western-Blot过程步骤详解中英文对照实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
WesternBlotting(半干转)超级详细步骤(精)
Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A ．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g从-80°C 冰箱取出，按1:10 (w:v加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA ；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF ）2. 用 Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用 Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置 20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C ，15 min，取上清。
B ．核蛋白提取1. 称取 100 mg 肝脏冰冻组织置于 Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A ，上下抽动 5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入 1.5 mL 离心管，瞬时离心 30 s3. 上清倒入另一 1.5 mL 离心管，冰浴 5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C ，10 min，上清倒入另一 1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液 B 吹打，冰浴 20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C ，20 min，将上清吸入 0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。
二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu 2+还原为 Cu +，一个Cu +螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
1．BCA 标准品和样品的准备：（BCA 标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL 原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL 上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS 缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。
WesternBlot原理和操作方法（详细）
另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.
重要参数
①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:
TEMED(μl) 8 4
总体积(ml) 6 3
蛋白质的样品制备：
蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：
1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
2)组织样品的制备：
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）
WB步骤详解
路。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
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合起夹子
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将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面 对槽的红面。
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电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
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加上转移缓冲液
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盖上盖子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋
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电转移200mA 2-3h后，打开盖子，取出夹子
插入另一块玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一
块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外
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两块玻璃板都放好后夹紧（拇指按下夹子）
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ห้องสมุดไป่ตู้13
放入电泳槽中
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向内槽中加电泳缓冲液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，
就要重新把玻板查好，使内外不交通。 电泳液至少要漫过内
侧的小玻璃板。
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梳子已经插好。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固
时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以
在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
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浓缩胶干后，用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子
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将玻璃板从夹子上取下，用水冲一下
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将玻璃板放入电泳槽中。小玻璃板面向内，大玻璃板面向外
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室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
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按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
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第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加入 TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用TBST 洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法显影。
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Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。
二、蛋白样品制备1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。
（提前开离心机预冷）（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
三、蛋白含量的测定1. 制作标准曲线（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）混匀后，室温放置2 min。
在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 检测样品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。
室温放置30 min后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl 溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳1. 清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。
）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3. 电泳电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
五、转膜1. 转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一定要小心，玻板很易裂。
）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
）5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
六、免疫反应1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。