蛋白质分子基础5蛋白质一级结构测定
蛋白质结构测定实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质结构测定的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质一级结构和三维结构的测定方法。
3. 了解蛋白质结构测定在生物学研究中的应用。
二、实验原理蛋白质是生命活动中的重要分子，其结构决定了其功能。
蛋白质结构测定是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
蛋白质结构测定主要包括一级结构测定和三维结构测定。
1. 蛋白质一级结构测定：蛋白质一级结构是指氨基酸的排列顺序。
测定蛋白质一级结构的方法有化学裂解法、蛋白酶水解法、高效液相色谱法等。
2. 蛋白质三维结构测定：蛋白质三维结构是指蛋白质分子在空间中的形态。
测定蛋白质三维结构的方法有X射线晶体衍射法、核磁共振法、冷冻电镜法等。
三、实验材料1. 蛋白质样品：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）等。
2. 试剂：硫酸铵、氯化钠、丙酮、乙腈等。
3. 仪器：高效液相色谱仪、核磁共振仪、X射线晶体衍射仪、冷冻电镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质一级结构测定（1）将蛋白质样品进行化学裂解，得到多肽片段。
（2）使用高效液相色谱仪对多肽片段进行分离，得到单个多肽。
（3）对单个多肽进行质谱分析，得到氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定（1）将蛋白质样品进行X射线晶体衍射实验，得到蛋白质晶体。
（2）对蛋白质晶体进行X射线衍射，得到衍射图谱。
（3）根据衍射图谱，计算蛋白质分子的三维结构。
3. 蛋白质结构分析（1）使用核磁共振仪对蛋白质样品进行NMR实验，得到蛋白质分子的三维结构。
（2）将NMR实验结果与X射线晶体衍射结果进行对比，验证蛋白质结构。
五、实验结果与分析1. 蛋白质一级结构测定通过高效液相色谱仪和质谱分析，成功测定了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定通过X射线晶体衍射实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
3. 蛋白质结构分析通过NMR实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
与X射线晶体衍射结果进行对比，验证了蛋白质结构。
蛋白质一级结构测定
氨基酸与肽的定量组成测定
定量组成测定，第一步是将蛋白质水解 为基组成氨基酸。 蛋白质的水解方法有： 1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真 空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时
特点： （1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。 （2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转 变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。
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蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中 氨基酸的组成、排列顺序连接方式和 二硫键的位置。 在生物化学与分子生物学中不少问题 都面临着需要知道蛋白质一级结构的 情况。如研究蛋白质的结构与功能的 关系、酶的结构与功能的关系、一级 结构与高级结构的关系等。因此，只 有把一级结构研究清楚之后，我们才 能研究生命过程中的许多复杂问题。
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（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋 酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈 玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较 好。但反应混合物中的含水量对显色有 一定影响。因此，不如对-二甲基氨基 苯甲醛法使用广泛。
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氨 基 端 的 分 析
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley 等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽 或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光， 由此产生了测定N末端的新方法，称 DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有 相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了 100倍，使用更为广泛。
对氯汞苯甲酸与巯基反应， 形成巯基的对氯汞苯甲酸 衍生物（PCMB）。PCMB 最大吸收在233nm摩尔消光 值为1.96×104。与巯基形 成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在 250nm处差值最大，这个差 值与参与反应的试剂量有 直接关系。测定时，用含 巯基化合物支滴定固定量 的汞试剂，直至吸收差值 不再增加为止，根据汞试 剂的量可以计算出巯基数 量。由于测定是在蛋白质 的吸收范围内进行，因此 必须作蛋白质含量对吸收 36 影响的校正。
第三章蛋白质一级结构的测定
不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。
不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
蛋白质一级结构测序解析
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
胰岛素
-巯基乙醇
碘乙酸
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式： a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在 水中的溶解度
（NH）
脲或胍 脲或胍
（四）氨基酸组成的分析
氨基酸分析仪进行测 定，测定每条多肽链 的AA组成，并计算出 AA成分的分子比。
（五）裂解多肽链成较小的片段
酶解法：如胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 化学法：如溴化氰法 羟胺法
二硫键位置的确定
+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。
含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
蛋白质一级结构测序原理
蛋白质一级结构测序原理
蛋白质一级结构测序是通过确定蛋白质中氨基酸的序列来确定其一级结构的方法。
有两种常用的方法用于蛋白质一级结构的测序：酶法和质谱法。
酶法是最常用的测定蛋白质一级结构的方法之一。
这种方法利用特定的酶将蛋白质分解成小片段，然后通过测定每个片段中氨基酸残基的类型和顺序来确定蛋白质的氨基酸序列。
其中，最常用的酶是胰蛋白酶和胃蛋白酶，它们在特定的条件下能够切割蛋白质中的肽键。
通过将蛋白质与这些酶反应，可以生成一系列的片段，这些片段之间存在特定的顺序关系。
接下来，通过分离和测定每个片段中的氨基酸数量和类型，可以推断出蛋白质的氨基酸序列。
质谱法是另一种常用的测定蛋白质一级结构的方法。
这种方法利用质谱仪对蛋白质进行分析，并测定其分子量和氨基酸成分。
在质谱仪中，蛋白质会被电离成荷质比之后进行分子量测定。
通过测量荷质比，可以推断蛋白质的氨基酸序列。
质谱法相比酶法的优势在于其速度更快且能够直接测定大分子量的蛋白质。
综上所述，蛋白质一级结构测序的原理主要包括酶法和质谱法。
通过分析蛋白质中氨基酸的序列，可以确定蛋白质的一级结构。
蛋白质一级结构测定详解
蛋白质一级结构测定详解蛋白质一级结构测定是指确定蛋白质分子中氨基酸的序列顺序。
蛋白质的一级结构决定了蛋白质的功能和特性，因此准确测定蛋白质的一级结构对于理解蛋白质的功能和研究蛋白质的生理机制非常重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质一级结构测定方法。
1.编码方法：蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学技术直接从DNA的序列中获取。
通过DNA的转录和翻译过程，蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学方法快速测定。
这种方法适用于已经测定过基因组的生物。
2.氨基酸分析法：氨基酸分析法是一种传统的蛋白质一级结构测定方法，通过将蛋白质水解成氨基酸，然后使用氨基酸分析仪来测定各种不同的氨基酸的含量和种类。
这种方法可以确定蛋白质中各种氨基酸的相对含量和比例，从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
3.编码二维电泳：编码二维电泳是一种结合二维凝胶电泳和质谱技术的方法，可以用来测定蛋白质的一级结构。
首先，将蛋白质进行酶解，然后使用不同标记的肽酶消化蛋白质样品，并通过二维凝胶电泳将消化产物分离。
然后，将二维凝胶电泳的凝胶切割成片段，使用质谱仪进行质谱分析。
最后，根据质谱分析的结果确定蛋白质的氨基酸序列。
4.氨基酸测序法：氨基酸测序法是一种直接测定蛋白质氨基酸序列的方法，通过测定蛋白质中氨基酸的顺序，可以确定蛋白质的一级结构。
氨基酸测序法通常使用肽酶来酶解蛋白质，并使用街染色物质标记氨基酸。
然后，通过比色法或质谱仪等方法测定每个氨基酸的相对含量或精确质量，最终确定蛋白质的氨基酸序列。
综上所述，蛋白质一级结构测定方法有很多种。
不同的方法适用于不同的实验目的和条件。
选择合适的方法来测定蛋白质一级结构非常重要，可以提供宝贵的信息来理解蛋白质的功能和特性。
随着技术的不断发展，蛋白质一级结构测定的准确性也在不断提高，相信将来会有更多的方法被开发出来来解析蛋白质的一级结构。
蛋白质一级结构的测定方法
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3）氨基酸组成分析 酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来 用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应 用。
测定蛋白质的分子量
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘磺 过滤法，沉降系数法
酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
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及测定的一般步骤
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（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根 据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
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羧肽酶法
第二节 蛋白质一级结构 的测定
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一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行 排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称 为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位置。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋
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（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质结构鉴定
百泰派克生物科技
蛋白质结构鉴定
蛋白质的分子结构分为四级，蛋白质结构鉴定指的是对蛋白质的这四级结构进行鉴定。
质谱可以用于蛋白质一级结构的鉴定。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质一级结构鉴定服务。
蛋白质结构
蛋白质结构是氨基酸链分子中原子的三维排列。
蛋白质是一种聚合物，特别是多肽是由氨基酸序列(聚合物的单体)形成的。
单个氨基酸单体也可以被称为残基，表示一个聚合物的重复单元。
蛋白质是由氨基酸经过缩合反应形成的，其中氨基酸在每个反应中损失一个水分子以便通过肽键相互连接。
为了能够发挥其生物学功能，蛋白质会折叠成一个或多个特定的空间构象，这些构象是由许多非共价相互作用驱动的，例如氢键，离子相互作用，范德华力和疏水堆积。
蛋白质结构鉴定
蛋白质的分子结构分为四级，其中一级结构指蛋白质多肽链中氨基酸的序列。
蛋白质的一级结构决定了其它高级结构，并定义了蛋白质的功能，因此鉴定蛋白质的一级结构是很重要的。
质谱法可以用于蛋白质一级结构的鉴定，即鉴定蛋白质的氨基酸序列。
为了了解蛋白质在分子水平上的功能，通常需要确定其三维结构，这是结构生物学领域范畴，可采用诸如X射线晶体学，NMR光谱，低温电子显微镜
（cryo-EM）和双偏振干涉法等技术来确定蛋白质的结构。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质结构测定的方法
应用：( Ⅰ) 研究生物大分子及其复合物在溶液中的
三维结构和功能; ( Ⅱ) 研究动态的生物大分子之间以及与配基
的相互作用; ( Ⅲ) 研究生物大分子的动态行为; ( Ⅳ) 用固体核磁共振或液体核磁共振技术研
究膜蛋白的结构与功能; ( Ⅴ) 研究蛋白质折叠,折叠动力学; ( Ⅵ) 用于药物筛选与设计; ( Ⅶ) 研究代谢组学; ( Ⅷ) 研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用; ( Ⅸ) 核磁成像用于认知科学研究.
传播方向看好似做圆周运动——circularly polarized
light
▪ 右圆偏振光：面对光源
E
H
电场矢量顺时针转动
左圆偏振光：面对光源
传播方向
电场矢量逆时针转动
入
圆二色性（ CD， circular dichroism）
旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同，导致振幅变 化，从而产生椭圆偏振光的现象。
蛋白质空间结构国内外研究动态
在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶 体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80% 的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁 共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的 重要性,最近几年,它们都有很大的改进.
（五） 扫描隧道显微技术（STM， scanning tunneling microscope）：
STM的工作原理：
▪ 扫描隧道显微镜的工作原理是基于 量子力学中的隧道效应。对于经典 物理学来说，当一个粒子的动能E 低于前方势垒的高度V0时，它不可 能越过此势垒，即透射系数等于零 ，粒子将完全被弹回。而按照量子 力学的计算，在一般情况下，其透 射系数不等于零，也就是说，粒子 可以穿过比它能量更高的势垒，这 个现象称为隧道效应。
蛋白质的一级结构及分析
多肽具有特征性的氨基酸 组成，多肽或蛋白质以酸 水解产生游离-氨基酸 的混合物。当完全水解时 ，每一种类型的蛋白质产 生一种特征性的氨基酸比 例或混合物。20种氨基酸 几乎从不以相同的比例出 现在一个蛋白质中，有高 有低，甚至有的只出现一 次或根本不出现。
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出 蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
• 多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以 下的称为多肽。
• 肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水 解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下 的半衰期为7年。
肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一 个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键
水解
缩合
氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的 氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位 被称为残基（residue），带有游离-氨基的一端被称为氨基（末） 端（或N端），带有游离-羧基的一端被称为羧基（末）端（或 C端）。
received Nobel Prize in Chemistry in 1958.
• In 1965, he developed the chain termination method, also known as the "Sanger method." He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 "for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids."
蛋白质分子基础5-蛋白质一级结构测定
C末端分析
a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂 α－氨基醇 ↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定
羧肽酶法
羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
巯基含量测定
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB) Protein-S-S-R+RSProtein-SH Protein-S-S-Protein+RS-(CNT) R
-
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
优点:Trp在水解中不受破坏。
蛋白质的水解
磺酸水解
4mol/L 甲基氨酸 ( 含 0.2%β- 吲哚乙胺 ) 色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
蛋白质化学
蛋白质一级结构的测定
序列测定的基本方法学
将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
序列测定一般步骤
纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一结构
一、蛋白质的一级结构（Primary structure）又称为共价结构或化学结构。
它是指蛋白质中的氨基酸依照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。
肽键：一个氨基酸的α-COOH 和相邻的另一个氨基酸的α-NH2脱水形成共价键。
1)组成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；2)肽链中的氨基酸的排列顺序，一样-NH2端开始，由N指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。
肽的颜色反映: 多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反映。
这些显色反映，可用于多肽的定性或定量鉴定。
如黄色反映，是由硝酸与氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反映生成二硝基苯衍生物而显黄色。
多肽的双缩脲反映是多肽特有的颜色反映;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而取得的产物。
双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反映。
含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反映，生成紫红色或蓝紫色络合物。
这是多肽定量测定的重要反映.（二）天然活性肽1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu-Cys-Gly），谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸普遍存在于生物细胞中，含有自由的-SH，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，爱惜某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。
2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可增进甲状腺素的释放。
3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，要紧作用于细胞膜。
4.青霉素：含有D—半胱氨酸和D—缬氨酸的二肽衍生物。
要紧破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引发溶菌。
蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界限，一般是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量转变范围专门大, 从大约6000到1000000道尔顿乃至更大。
一、蛋白质的一级结构p1681. 概念—— 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。
蛋白质一级结构测序-1
Edman
H
O
O
氨
N C S HN CHC NHCHC
基
R1
R2
酸 顺 序
H
N C S: O
O
HN CH C NH CH C
H
N C S NH2
NH C O CH
O CH C R2
分
R1
R2
R1
析
N CS
O
NH 3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
保 护 作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
S
S
S
S
胰岛素
SH
HSHO-CH2-CH2-SH
SH
SH
SH
SH
ICH2COOH SCH2C00HSCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
蛋白质测定的详细步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋
白 质
白质分子量之间的关系，即可确定多肽
一 链的数目。
级
结
构
的
测
定
B.多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须 蛋 先进行拆分。
白 质 一 级 结 构 的 测 定
B.多肽链的拆分。
蛋 几条多肽链借助非共价键连接在一起，
•
换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的
位 对角线电泳技术进行分离。
置 的 确
• 然后同其它方法分析的肽段进行比较， 确定二硫键的位置。
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➢ 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
❖第8页/共59页
蛋白质的水解
酶的水解 ➢ 选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可
以使蛋白质水解成游离的氨基酸。
➢ 优点：
其他水解不稳定的氨基酸，如Trp、Asn、Gln等，都可 以用此方法。
➢ 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。
➢ 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
❖第7页/共59页
蛋白质的水解
磺酸水解
➢ 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。
➢ 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。
➢ 释放的肽可用Edman等方法等正常方法测 定。
➢ N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用 甲酰基酶除掉。 ❖第22页/共59页
❖第23页/共59页
❖第24页/共59页
❖第25页/共59页
❖第26页/共59页
❖第27页/共59页
❖第28页/共59页
❖第29页/共59页
❖第30页/共59页
❖第31页/共59页
❖第32页/共59页
❖第33页/共59页
❖第34页/共59页
❖第35页/共59页
C末端分析
➢ a)肼解法 ➢ b)还原法：硼氢化锂还原剂 ➢ c)羧肽酶法（最有效、常用）
❖第36页/共59页
肼解法
❖
❖第37页/共59页
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂
α－氨基醇 ↓水解
H+ O2N
H2O
N-端氨基酸 RO
HN CH C OH
NO2 DNP-氨 基 酸 ❖第17页/共59页NO2 DNP衍生物Fra bibliotek+ 氨基酸
Edman反应-PITC与多肽的反应
H
O
O
NC S
H N CH C NH CH C
R1
R2
H
N C S: O
O
HN CH C NH CH C
R1
R2
H
NC S NH C O CH
水解过程中许多AA都受到不同程度的破坏，产率 不高。 水解产物发生消旋化。
➢ 优点:Trp在水解中不受破坏。
❖第6页/共59页
蛋白质的水解
磺酸水解
➢ 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。
➢ 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。
❖第14页/共59页
末端氨基酸的测定
❖第15页/共59页
N-末端的测定
➢ sanger反应 ➢ Edman反应 ➢ 丹磺酰氯(DNS)法 ➢ 氨肽酶法
❖第16页/共59页
Sanger反应——2、4—二硝基氟苯（DNFB）反应
RO
RO
O2N
F + H2N CH C
O2N
HN CH C
NO2 DNFB
R1
N CS
C NH +
O CH
❖第18页/共R519页
NH2
O CH C R2
Edman反应
➢ 苯异硫氰酸酯（PITC）法：
多肽 or 蛋白质末端NH2＋PITC
↓
PTC－多肽 or 蛋白质
↓有机溶剂
┌－－－－－－N末端的PTC－AA发生环化
∣
生成苯乙内酰硫脲的衍生物
∣
↓
∣
脱离肽链
∣
除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。
➢ 优点:不容易引起水解产物的消旋化。
➢ 缺点:Trp被沸酸完全破坏；
有-OH的Ser或Thr小部分被分解； Asn和Gln侧链的酰胺基→-COOH。 注:加入0.1-1%巯基乙醇和0.05-0.1%苯酚, Tyr或Thr 收率提高
❖第5页/共59页
蛋白质的水解
碱水解
➢ 5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 ➢ 缺点:
➢ 缺点：
不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。
❖第9页/共59页
氨基酸的分离与含量测定
❖第10页/共59页
❖第11页/共59页
特殊氨基酸的测定
❖第12页/共59页
色氨酸的测定
➢ 紫外吸收法 ➢ Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比
例，可用方程计算出Trp的含量：
蛋白质一级结构的测定
❖第1页/共59页
序列测定的基本方法学
➢ 将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
❖第2页/共59页
序列测定一般步骤
➢ 纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
➢ 分子量测定 ➢ 多肽链的组成，二硫键的断裂。
-SH，-S-S- + HCOOOH
➢ 蛋白质的氨基酸的组成。 ➢ 蛋白质的配基 ➢ 蛋白质的端基分析 ➢ 进行正常的序列测定****
❖第3页/共59页
-SO3H
蛋白质和肽的氨基酸组成
❖第4页/共59页
蛋白质的水解
酸水解
➢ 6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸,105-110℃ 水解20小时。
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB)
R
Protein-S-S-R+RS-
-
Protein-SH
Protein-S-S-Protein+RS-(CNT)
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
Trp ＝ (A288Tyr*1280) －(A280Tyr*385)
Tyr
(A280Trp*4815) －(A288Trp*5690)
➢ 对－二甲基氨基苯甲醛法
Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下 有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用 此法测量Trp含量。
❖第13页/共59页
巯基含量测定
↓ （因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）
干燥
/∣\
薄层 气相 HPLC
层析 色谱
❖第19页/共59页
丹磺酰氯（DNS）法
❖第20页/共59页
封闭的N末端的测定
❖第21页/共59页
封闭的N端测序
❖ 末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦 谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨 酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出 少一个Gln的肽。
C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓
色谱法鉴定
❖第38页/共59页
羧肽酶法
➢ 羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。