免疫细胞的分离技术22页PPT文档
免疫细胞的分离和保存技术
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
免疫细胞分离技术
上海交通大学医学院
人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫细胞的分离技术PPT幻灯片
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免疫细胞的分离
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ห้องสมุดไป่ตู้
三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法
❖ 1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体 +磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细 胞
❖ 2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
特定细胞 13
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免疫磁珠法分选装置
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三、免疫细胞亚群的分离 —流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）
FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标 志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将 不同类型的细胞分选收集。
原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细
胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷 嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串 的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经 激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。
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免疫细胞的分离
❖ 人外周血单个核细胞的分离 ❖ 淋巴细胞的分离 ❖ 免疫细胞亚群的分离
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细胞分离原理
❖ 细胞的大小和比重 ❖ 细胞表面标志 ❖ 细胞黏附于各种物质表面的特性
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一、人外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll分层离心法
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。
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三、免疫细胞亚群的分离
❖免疫磁珠分离法 ❖流式细胞术
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
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免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
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（一）外周血单个核细胞分离
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
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其他细胞
自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中 性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
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免疫细胞的特征
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方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
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免疫磁珠法 （Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
免疫细胞分离技术
免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是一种重要的生物学和医学研究工具，广泛应用于生物样本中细胞的分离和纯化。
通过利用细胞表面的特异性标记，免疫细胞分离技术可以实现对不同类型细胞的高灵敏度、高特异性的分离。
在免疫学研究领域，免疫细胞分离技术被广泛应用于研究免疫细胞的功能和相互作用，对于深入理解免疫系统的机制具有重要意义。
免疫细胞分离技术的基本原理是利用抗体与特定细胞表面标记结合的高度特异性，通过各种分离方法将该细胞与其他非特异性细胞分离开来。
免疫细胞分离技术通常包括两个关键步骤：抗体与目标细胞的特异性结合和分离纯化。
在抗体结合的过程中，通过将抗体与目标细胞共孵育，使抗体与目标细胞表面标记结合形成抗原-抗体复合物。
而在分离纯化的过程中，可以通过多种方法将抗原-抗体复合物与其他非特异性细胞分离开来，如磁性珠分离、流式细胞仪分离等。
免疫细胞分离技术的关键是选择合适的特异性抗体。
抗体是由机体免疫系统产生的一种高度特异性的蛋白质，具有与目标抗原结合的能力。
在选择抗体时，需要考虑以下几个因素：第一，抗体的特异性；第二，抗体的亲和力和亲和常数；第三，抗体的结合位点；第四，抗体的格式和标记。
合理选择和设计抗体可以提高免疫细胞分离技术的效率和准确性。
在免疫细胞分离技术中，常用的方法之一是磁性珠分离法。
该方法利用表面覆有特定抗体的磁性珠与目标细胞结合，通过磁外场将目标细胞分离出来。
磁性珠分离法具有分离效率高、操作简便、适用范围广等优点，被广泛用于体外培养细胞、临床诊断和基础研究等领域。
另一种常用的免疫细胞分离技术是流式细胞仪分离法。
流式细胞仪是一种高速流动和高灵敏度激光共聚焦技术，可以对单个细胞进行多参数检测和鉴定。
在流式细胞仪分离中，通过合适的荧光染料或荧光标记抗体，结合流式细胞仪对细胞进行定量、快速分析和筛选。
流式细胞仪分离技术具有分离速度快、高通量、对样本体积要求小等优点，广泛应用于细胞表型分析和免疫学研究。
除了磁性珠分离法和流式细胞仪分离法，还有其他依赖于抗体与抗原结合的分离方法，如免疫磁珠分离法、免疫离心法、免疫亲和层析法等。
免疫细胞的分离和功能测定PPT文档共55页
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
免疫细胞的分离和功能测定
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
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谢谢！
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免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的别离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反响的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反响的细胞从血液或脏器中别离出来。
参与免疫反响的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，别离细胞的需求和技术也异。
有的仅需别离白细胞，有的则需别离单个核细胞〔mononuclearcell〕，其中含淋巴细胞和单核细胞〔monocyte〕，有的则需别离T细胞和B细胞以及其亚群。
别离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用别离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的外表标志，包括细胞外表的抗原和受体加以选择性别离。
一、白细胞的别离〔一〕血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以别离。
本法是利用血细胞自然沉降率的别离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后参加少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
〔二〕聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮〔polyvinylpyrolidone，PVP〕等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞别离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的别离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞的分离技术共23页文档
免疫细胞的分离
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流式细胞仪
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免疫细胞的分离
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免疫细胞的分离
❖ 人外周血单个核细胞的分离——Ficoll分层离 心法
❖ 淋巴细胞的分离——尼龙棉柱法、E花环 分离法、补体细胞毒法免疫荧光法
❖ 免疫细胞亚群的分离——免疫磁珠分离法、 流式细胞术
谢谢！
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免疫细胞的分离
单个核细胞 1.070 分层液 1.077
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免疫细胞的分离
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一、人外周血单个核细胞的分离
——Ficoll分层离心法
Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。
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免疫细胞的分离
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二、淋巴细胞的分离
❖ 尼龙棉柱法 ❖ E花环分离法 ❖ 补体细胞毒法免疫荧光
❖ 2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
特定细胞
免疫磁珠法分选装置
三、免疫细胞亚群的分离 —流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）
FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标 志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将 不同类型的细胞分选收集。
原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。
原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心
沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的 单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。
2021/8/20
免疫细胞的分离
免疫细胞的分离和保存技术PPT共31页
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
10、倚南窗以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
免疫细胞的分离和保存技术
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、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
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免疫细胞的分离
❖ 人外周血单个核细胞的分离 ❖ 淋巴细胞的分离 ❖ 免疫细胞亚群的分离
2020/4/10
免疫细胞的分离
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细胞分离原理
❖ 细胞的大小和比重 ❖ 细胞表面标志 ❖ 细胞黏附于各种物质表面的特性
2020/4/10
免疫细胞的分离
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一、人外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll分层离心法
❖ 2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
特定细胞
免疫磁珠法分选装置
三、免疫细胞亚群的分离 —流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）
FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标 志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将 不同类型的细胞分选收集。
原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。
原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心
沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的 单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。
2020/4/10
免疫细胞的分离
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不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092
单个核细胞 1.070 分层液 1.077
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免疫细胞的分离
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一、人外周血单个核细胞的分离
——Ficoll分层离心法
Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。
2020/4/10
免疫细胞的分离
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二、淋巴细胞的分离
❖ 尼龙棉柱法 ❖ E花环分离法 ❖ 补体细胞毒法免疫荧光
免疫细胞的分离
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流式细胞仪
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免疫细胞的分离
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免疫细胞的分离
❖ 人外周血单个核细胞的分离——Ficoll分层离 心法
❖ 淋巴细胞的分离——尼龙棉柱法、E花环 分离法、补体细胞毒法免疫荧光法
❖ 免疫细胞亚群的分离——免疫磁珠分离法、 流式细胞术
谢谢！
2020/4/10
免疫细胞的分离
＊成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，CD2分 子），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。
＊ E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。 ＊ E花环周围的绵羊RBC可 用低渗法除去。
三、免疫细胞亚群的分离
❖免疫磁珠分离法 ❖流式细胞术
2020/4/10
免疫细胞的分离
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三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法
法
2020/4/10
免疫细胞的分离
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二、淋巴细胞的分离
——尼龙棉柱法
原理：B细胞和单核细胞具有易黏附的特性，
将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37 ℃作 用1~2h后，洗脱的为非黏附性的T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤 维棉柱
2020/4/10
T细胞免疫细胞的分离
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二、淋巴细胞的分离
— E花环分离法（纯化T细胞） 原理
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胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷 嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串 的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经 激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。
2020/4/10
免疫细胞的分离
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流式细胞仪工作原理
2020/4/10
原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠
（Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁 珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞 相连， 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性 分
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三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法
❖ 1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体 +磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细 胞
免疫细胞
❖ 1、概念
直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。
❖ 2、分类
＊单核吞噬细胞系统：单核细胞 / 巨噬细胞 树突状细胞（DCs)
＊淋巴细胞系统：T 淋巴细胞 （Th / Tc) B 淋巴细胞 NK 细胞
＊粒细胞系统: 中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞
2020/4/10
免疫细胞的分离