地高辛标记探针的Southern 杂交
地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点
地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点地高辛标记探针在Sou thern杂交分析中的技术要点陆小平周文军(苏州大学生命科学学院江苏苏州215006)小岛峰雄(日本信州大学纤维学部)外源基因是否成功导入受体材料的基因组中,必须从转化植株中找到分子生物学的检测证据。
目前,PCR、Southern杂交等作为常用检测手段而被广泛采用。
虽然PCR技术可以快速得到结果,但是,以农杆菌介导的材料必须慎重这一结论,以免由于农杆菌污染造成假阳性。
而Southern分析由于操作程序繁琐,对植物基因组DNA的提取、纯化、酶切等技术要求较高,有时使杂交结果不甚理想。
我们在植物基因转化的研究中,对荞麦,桑树,紫景天,洋麻等基因组DNA的提取、纯化、酶切进行了探讨,对流程中的有关步骤进行技术改良,使酶切后的PNA在凝胶板上是涂布状完全达到了Southern杂交的技术要求,并用地高辛(D ig)标记探针对外源DNA进行分析,取到了较好的效果。
现简述如下∶1 植物基因组D NA的提取及纯化1)提取高纯度的DNA是Southern杂交的关键, DNA的粗提物中,往往含有大量的蛋白质、多糖、单宁、色素等大分子杂质。
这些杂质通常与DNA共同沉淀或与DNA聚合成大分子复合物。
一旦复合物形成,即便在以后的操作中用酚、氯仿多次纯化,也很难将其除去。
我们的经验是:当用液氮破碎新鲜样品的细胞壁后,先用蒸馏水洗脱两次(洗脱温度为42℃),每次5m in。
以达到洗脱多糖的目的。
每次洗脱后离心5m in(13000 r m in),弃去上层液。
该上层液中含有粘度较高的胶状体,其主要成分可能是粘性多糖。
在提取桑树基因组DNA时,最好用叶柄或幼茎、幼叶作提取材料。
在样品有限时,也可用成熟叶甚至老叶代替。
据C lark M S (1998)介绍,取样前对材料进行除淀粉处理(减少光照、黑暗处理24h),可以抑制多糖的污染。
但我们采用除淀粉处理后的实验结果并不理想,其效果远不及用蒸馏水洗脱。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
地高辛标记探针的Southern杂交
地高辛标记探针的Southern 杂交（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）1. 探针标记步骤（20µl 体系）：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。
2)沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。
3)充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 µl至变性DNA管，混匀并离心。
4)37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。
5)停止反应，加2 µl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。
2. 探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。
操作步骤如下：1)根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量表2)将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分钟5)将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟6)将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟7)用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟8)在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟9)将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。
southern杂交原理
southern杂交原理Southern杂交原理是一种分子生物学技术，常用于研究DNA序列。
它是由爱德华·南方（Edwin Southern）于1975年提出的，被广泛应用于DNA杂交等领域。
Southern杂交原理主要是通过将DNA样品与DNA探针杂交，然后用放射性同位素或化学荧光等方法检测杂交的情况，从而确定目标DNA序列的存在与否。
这一原理的核心是通过互补配对的碱基间形成稳定的双链结构，从而实现DNA的特异性识别与检测。
在Southern杂交实验中，首先需要提取待检测的DNA样品。
这可以通过细胞裂解、DNA纯化等方法来完成。
然后，将目标DNA序列与DNA探针进行杂交反应。
DNA探针是一段已知序列的DNA 片段，通常是标记有放射性同位素或荧光染料的单链DNA。
在杂交反应中，目标DNA序列与DNA探针通过互补配对的碱基结合在一起形成双链结构。
通过探针的标记物可以追踪杂交的情况。
放射性同位素通常用于探测杂交产物，而化学荧光则常用于非放射性检测。
完成杂交反应后，需要进行杂交产物的检测与分析。
对于放射性同位素标记的探针，可以通过放射性测量仪来检测杂交产物的放射性信号强度。
而对于化学荧光标记的探针，可以通过荧光显微镜或荧光成像仪来观察和记录荧光信号。
Southern杂交原理的应用非常广泛。
例如，它可以用于检测特定基因的存在与表达情况，研究基因组结构与功能，鉴定DNA的来源，进行亲缘关系分析等。
此外，Southern杂交还可以与其他分子生物学技术相结合，如聚合酶链反应（PCR），构建DNA文库等，进一步拓展其应用范围。
Southern杂交原理是一种重要的分子生物学技术，通过DNA的互补配对和标记物的检测，实现了对目标DNA序列的高度特异性识别与检测。
它在基础研究、临床诊断、法医学等领域具有广泛的应用前景，为科学研究和医学诊断提供了有力的工具和方法。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
southern杂交
Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。
该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。
Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。
原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。
该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。
随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。
步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。
2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。
3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。
4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。
5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。
6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。
7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。
8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。
应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。
2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。
3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。
4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。
5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。
具体了解Southern杂交技术
Southern Blotting的过程
1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
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四、Southern杂交的应用
– DNA指纹分析
具体了解Southern杂交技术
滤膜（固相）杂交
具体了解Southern杂交技术
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类： ③ 膜 杂 交 ： 用 标 记 DNA
或RNA探针检测固定在 硝酸纤维素（NC）膜 上 的 DNA 序 列 。 Brown 等应用这一技术评估 了 爪 蟾 rRNA 基 因 的 拷 贝数。
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三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类
cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物
[α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、 125I(60d)、14C、131I
胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜：
–硝酸纤维素膜 (NC) 、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空
转移法
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三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
第16讲
核酸分子杂交 ------Southern杂交
地高辛标记探针的Southern印迹方案
地高辛标记探针的DNA印迹方案Southern blot using DIG Prober(分子生物学实验室)Step I 采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记DNA探针1 以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。
2 取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。
3 沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性（1）摇匀DIG-High Prime（vial 1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。
4取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。
５标记好的DNA探针－20℃保存。
Step II 基因组DNA酶切1 提取高质量的基因组DNA，浓度>1μg/μl ; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。
2 选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。
注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。
50μl酶切反应体系：EcoR I (15U/μl ) 5μl10×M buffer 5μlgDNA 10μl（约10-20μg）ddH2O up to 50μl注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。
3 37℃酶切12h （电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。
65℃保温10min停止酶切反应。
Step III 预电泳和电泳1 配制0.8 %的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。
2 加入适量上样缓冲液（Loading Buffer）点样，点上质粒做对照。
注：两边的点样孔尽量空出来；点上marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。
分子生物学实验的常见问题与解决方案范文
分子生物学实验的常见问题与解决方案范文一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，对于大于15kb的DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTriHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
Southern northern western杂交应用
分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。
根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。
一、 Southern blotting1．转膜当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4）条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。
然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。
最后通过80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。
图4-2是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting 的经典装置图。
2．分子杂交2.1 预杂交将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
2.2 杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。
2.3 洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
3．检测3.1 放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。
在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。
而在标记 5' 末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP 。
放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。
3.2 非放射性标记、检测。
其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（digoxygenin, DIG）标记核酸探针。
southern杂交技术
Sourthern杂交技术摘要: 使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入外源基因拷贝数。
以含有外源基因水稻转基因植株叶片为材料, CTAB法少许抽提总DNA, 总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上, 最终与地高辛标识探针进行杂交。
经过条带有没有来判定是否为含有外源基因转基因植物, 条带多少反应了转基因植株中外源基因拷贝数。
结果:关键词: 抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学经典试验方法。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判定等研究中。
但因为该技术操作比较烦琐、费时, 所以现在有部分其她方法能够替换Southern 杂交。
但该技术也有它独特之处, 是现在其她方法所不能替换, 如限制性酶切片段多态性(RFLP)检测等。
1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标识系统试剂盒等。
1.2水稻总DNA少许抽提CTAB法抽提DNA步骤:(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻, 研磨成细粉;(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管, 加入1ml预热至95ºC以上1.5⨯CTAB, 混匀;(3)65ºC水浴中放置30分钟以上, 每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性, 促进内溶物释放);(4)1g离心2分钟;(5)吸收600μl上清于新1.5ml离心管, 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）, 上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色;(6)1g离心5-10分钟;(7)吸收450μl上清于新1.5ml离心管, 加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc, 轻轻上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现;(8)1g离心10分钟;(9)弃去上清, 用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟, 除去离子及CTAB残余, 1g离心5分钟,弃上清,自然干燥;(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA）, 放于4ºC溶解;(11)充足溶解后, 测定并调整浓度。
地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进
生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００８年第３期收稿日期：２００７－１１－１９基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３０４６０００８）作者简介：刘立鸿（１９８２－），男，硕士生，生化与分子生物专业，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｊｌｉｕｌｉｈｏｎｇ１２３４＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：马正海（１９７１－），男，副教授，硕士生导师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｚｈｘｊｕ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ自１９７５年英国科学家Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ创立Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术以来，该技术已成为检测特定ＤＮＡ片段的经典杂交方法之一［１］。
此法快速、准确、灵敏，目前已经广泛地应用于医学、病毒学、转基因动植物鉴定、动物疾病诊断以及ＤＮＡ指纹分析等方面的研究。
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交中使用的标记探针有同位素与非同位素标记２种。
放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但存在半衰期限制，对操作者和环境会造成放射性辐射危害。
使用非同位素标记探针可避免放射性危害［２］，常规实验室大多采用后者，其中最常用的是地高辛标记探针［３］。
目前虽然有地高辛标记探针标记的试剂盒，但是试剂盒侧重于步骤流程描述，关于技术要点的介绍不是很多。
国内关于地高辛标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交法技术要点报道也较少。
在开展Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交中，参照文献并结合实验室的具体情况对该技术的具体步骤进行了一些探索和改进，现作一总结。
１技术要点１．１地高辛探针的标记与使用１．１．１探针的标记方法标记方法有缺口平移法、末端标记法、随机引物法和聚合酶链反应法（ＰＣＲ）等。
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交探针的制备一般用随机引物法，模板量应达到１μｇ以上，模板量不足１μｇ，可适当延长３７℃温育时间。
当模板序列已克隆在载体上，地高辛标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术要点及改进刘立鸿１许璐１汪凯２张富春１马正海１（１新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐８３００４６；２中国科学院上海巴斯德研究所，上海２０００２５）摘要：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术是检测特定ＤＮＡ片段的常规方法之一，其操作程序繁琐，对基因组ＤＮＡ的提取、纯化、酶切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需要反复摸索。
DIG探针的Southern 杂交
【实验目的】
1．了解Southern 杂交的基本原理及其应用。 2．掌握地高辛标记探针的Southern杂交的基本方法。
【实验原理】
1.探针合成： 1.1 PCR方法
变性后的线性 DNA
Байду номын сангаас
Taq酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 特异引物
【实验原理】
1.探针合成： 1.2 随机引物法
变性后的线性 DNA
Klenow酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 随机引物
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
标记 点样孔
切胶
凝胶
重物 吸水纸 厚滤纸 保鲜膜 转移缓冲液 支持物
吸水纸
玻璃板
尼龙膜 凝胶 厚滤纸
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
－ +
－ +
－
+
紫外交联
尼龙膜
吸水纸
3.探针杂交：
a.预杂交
尼龙膜
预杂交液
b. 杂交
加入已变性的探针
适宜的 杂交温度
适量的 探针
适宜的 杂交时间
4.检测反应 a.加入抗DIG-AP抗体（偶联了碱性磷酸酶的抗地高辛抗体）
加入抗体
4.检测反应 b.加入CSPD ready_to_use CSPD (ready to use)
4.检测反应 c.曝光，记录结果
GnRH
β-actin
Southern杂交技术手册
Southern杂交探针标记及检测试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II （detection with CSPD）原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和DIG-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用CSPD发光曝光到X光片。
试剂盒内容：1. DIG-High Prime，vial 1，50ul（5×）；2. 地高辛标记的对照DNA，vial 2，20ul（5ug/ml pBR328 DNA）；3. DNA稀释缓冲液，vial 3，（3×1ml）；4. AP Conjugate，vial 4，50ul（750U/ml）；开封后2-8℃稳定保存。
5. CSPD，vial 5，50 ml；开封后2-8℃避光稳定保存。
6. Blocking solution（封闭液），vial 6，4×100ml（10×）；开封后应分装，在-15～-25℃稳定保存，或2-8℃保存1个月，工作液应现用现配。
7. DIG Easy Hyb Granules，vial 7，4×100ml。
表1 需准备的其他试剂及设备过程设备试剂DIG标记探针水浴、电炉双蒸水，灭菌；0.2 M EDTA溶液（pH 8.0），灭菌。
探针灵敏度检测尼龙膜（Hybond-N+ NylonMembrane）洗脱缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液转膜转膜装置、紫外交联装置或烘箱TBE，酸变性液，碱变性液，中和液，20×SSC杂交电炉、冰水混合物、尼龙膜、杂交炉、杂交瓶20×SSC，1% SDS免疫检测洗脱缓冲液；马来酸缓冲液；检测缓冲液；重新杂交水浴20×SSC；1% SDS；1 M NaOH试剂配制：1. 马来酸缓冲液——0.1 M马来酸（M.W. 116.1），0.15 M NaCl，NaOH固体调pH至7.5，常温（称取11.61g马来酸，8.77g NaCl，定容至1000mL，高压灭菌）。
Southern印迹杂交实验原理和方法-3
Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。
但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。
下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。
探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。
探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。
以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。
室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。
由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。
因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。
Southern 杂交
Southern 杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备（前述）(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)二、基因组DNA的限制酶切(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)根据实验目的决定酶切DNA的量。
(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA 浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl）20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至500 μl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
Southern northern western杂交应用
分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。
根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。
一、 Southern blotting1．转膜当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4）条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。
然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。
最后通过80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。
图4-2是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting 的经典装置图。
2．分子杂交2.1 预杂交将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
2.2 杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。
2.3 洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
3．检测3.1 放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。
在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。
而在标记 5' 末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP 。
放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。
3.2 非放射性标记、检测。
其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（digoxygenin, DIG）标记核酸探针。
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地高辛标记探针的Southern杂交1.探针标记(20µL体系)：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。
2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。
3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4µl至变性DNA管，混匀并离心；4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）；5)停止反应，加2µL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。
若不用将于-20o C冰箱保存。
2.探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。
操作步骤如下：1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量Template DNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及Control DNA系列表Tube DNA(µl)FromTube#DNA dilutionbuffer(μl)Dilution Finalconcentration1Dilutedorginal1ng/µl 2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:100.01pg/µl90-50-01)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜；2)120o C固定30min或紫外交链3-5min；3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min；4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min；5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min；6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min；7)在10mL Detection buffer平衡2-5min；8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到5mL)中暗室条件下显色。
显色过程中不要摇动或振荡!9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。
3.凝胶处理：1)在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）；2)将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟(分两次)，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次；3)用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟(分两次)，将凝胶中和至中性，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；4)取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板，使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖4层滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡；5)取中和后的凝胶，点样孔向下地放在滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡；6)剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷，比胶大2mm），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20×SSC中浸泡5min；7)将浸润的膜准确地盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不再移动；8)将四张与膜大小相同的滤纸置于2×SSC溶液中浸润，盖在膜上，赶走气泡；9)滤纸上放一叠与吸水纸，吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板，玻璃板上压0.5kg重物，水平放置，转移4~18h；10)取下吸水纸及滤纸，揭去胶，将尼龙膜于2×SSC中浸泡5min，再置于滤纸上吸干；11)用滤纸包好印迹膜，DNA面朝上，120o C烘烤30min或置于紫外交联仪中紫外照射2min，将DNA交联在尼龙膜上，4o C保存备用。
注意，滤膜以下任何实验中都不应干燥！4.预杂交1)DIG Easy Hyb：将64mL无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37o C摇动溶解5分钟；2)计算杂交温度：通常为37o C-42o C，计算公式为：T m=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)(I=length of hybrid in base pairs)T opt.=T m-20to25o CFor sequences that are<80%homologous,the Thyb will be lower than that calculated above (approx.1.4°C lower per1%mismatch).3)预热一定体积的DIG Easy Hyb（10mL/100cm2膜）至杂交温度37-42o C；4)预杂交30分钟。
在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中下充分润湿；5)变性：DIG标记的探针（约25ng/ml）置98o C干浴锅中5min后迅速放在冰上冷却。
5.杂交1)将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5mL/100cm2）中，混匀，避免泡沫；2)倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液；3)继续在杂交温度下杂交6h至过夜。
注：含有探针的DIG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后用枪吸出放入1.5mL离心管中于-20o C保存，可重复使用几次，只需在使用前于68o C处理10min即可。
6.洗膜1)用2×SSC，0.1%SDS在15-25o C冷洗2次，每次5~10min，洗涤过程中要轻轻摇动；2)用0.5×SSC，0.1%SDS在65-68o C杂交管中热洗2次，每次15min。
For a probe with the e the following High StringencyHomology to Target GC-content Buffer Temperature 80–100%Average(40%)0.5x SSC+0.1%SDS65°C,if probe is>100bp<80%Average(40%)0.5x SSC+0.1%SDS Approx.60°C*80–100%High(50%)0.1x SSC+0.1%SDS68°C*Exact temperature must be determined empirically.7.检测1)杂交和洗膜后，用Maleic acid buffer浸泡1-5min；2)准备1×Block solution：用Maleic acid buffer10×稀释试剂（6#10×Blockingsolution）成1×的工作液，即每9mL Maleic acid buffer中加入1mL10×Blocking solution混匀，现配现用；3)按1ml/cm2的量取用1×Block solution，处理膜30min；4)将4#试剂离心，按1：5000加入1×Blocking solution，按20ml/100cm2的量用antibody solution处理膜30min；5)每次按1ml/cm2的量用Washing buffer洗膜2次，每次15min；6)按20ml/100cm2的用量，膜在detection buffer中平衡2-5min；7)准备Color-substrate solution（显色液）：从试剂5#中取100µL到5mL Detection buffer，要避光，现配现用；8)按10mL/100cm2的量加入新鲜配制的color solution浸润膜，放在塑料袋或塑料盒中，保持黑暗，注意不要在显色过程中摇动!9)颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16小时内完成显色反应，在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次。
当预期的斑点出现时，可在50mL TE buffer 或无菌超纯水中洗膜5分钟中止反应；10)照像记录结果。