地高辛标记探针的Southern 杂交

地高辛标记探针的Southern杂交

1.探针标记(20µL体系)：

1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。

2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。

3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4µl至变性DNA管，混匀并离

心；

4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）；

5)停止反应，加2µL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用

将于-20o C冰箱保存。

2.探针标记效率检测：

将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：

1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记

产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释

表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量

Template DNA1h20h

10ng45ng600ng

30ng130ng1050ng

100ng270ng1500ng

300ng450ng2000ng

1000ng850ng2300ng

3000ng1350ng2650ng

表2探针DNA及Control DNA系列表

Tube DNA(µl)From

Tube#DNA dilution

buffer(μl)

Dilution Final

concentration

1Diluted

orginal

1ng/µl 2211981:10010pg/µl

3152351:3.33pg/µl

452451:101pg/µl

553451:100.3pg/µl

654451:100.1pg/µl

755451:100.03pg/µl

856451:100.01pg/µl

90-50-0

1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜；

2)120o C固定30min或紫外交链3-5min；

3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min；

4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min；

5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min；

6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min；

7)在10mL Detection buffer平衡2-5min；

8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到

5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡!

9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相

染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。

3.凝胶处理：

1)在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，在紫外

灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）；

2)将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟(分两次)，并温和地不断振

荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次；

3)用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟(分两次)，将凝胶中和至中性，

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；

4)取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板，使盛器内的20倍SSC转移滤液低于

玻板表面，在玻板表面盖4层滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡；

5)取中和后的凝胶，点样孔向下地放在滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸

之间的气泡；

6)剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷，比胶大2mm），放在无菌超蒸

水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20×SSC中浸泡5min；

7)将浸润的膜准确地盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不再移动；

8)将四张与膜大小相同的滤纸置于2×SSC溶液中浸润，盖在膜上，赶走

气泡；

9)滤纸上放一叠与吸水纸，吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板，玻璃板上压

0.5kg重物，水平放置，转移4~18h；

10)取下吸水纸及滤纸，揭去胶，将尼龙膜于2×SSC中浸泡5min，再置于

滤纸上吸干；

11)用滤纸包好印迹膜，DNA面朝上，120o C烘烤30min或置于紫外交联仪

中紫外照射2min，将DNA交联在尼龙膜上，4o C保存备用。

注意，滤膜以下任何实验中都不应干燥！

4.预杂交

1)DIG Easy Hyb：将64mL无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37o C摇

动溶解5分钟；

2)计算杂交温度：通常为37o C-42o C，计算公式为：

T m=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)(I=length of hybrid in base pairs)

T opt.=T m-20to25o C