荧光原位杂交(fish)

荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

中文名

fish

外文名

fluorescent in situ hybridization

建立时间

1986年

发展历程

1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。尽管当时

原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。

1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。

1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。

随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。

操作步骤

编辑播报

（1）样品的固定；

（2）样品的制备和预处理；

（3）预杂交；

（4）探针和样品变性；

（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；

（6）漂洗去除未结合的探针；

（7）检测杂交信号，进行结果分析

·荧光信号观察：

将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。种属鉴定

·FISH最常使用的靶序列是16S rRNA，根据rRNA目标区域可设计寡核苷酸探针，进行种属特异性鉴定；

（1）寡核苷酸探针FISH技术

·最常用的寡核苷酸探针一般是15-30 bp，短的探针易于结合

到靶序列，但一般很难被标记；·探针的标记有直接标记和间接标记两种；

（2）核酸肽探针FISH技术

·核酸肽（Peptide Nucleic Acid，PNA）：一种不带电荷的DNA 类似物，其主链骨架是由重复的N-（2-氨基乙基）甘氨酸以酰胺键聚合而成，碱基通过亚甲基连接到PNA分子的主链上。·PNA/DNA分子杂交结合力、专一性都很高，由于没有电荷排斥力，使其杂交形成双螺旋结构的热稳定性高；·PNA探针能够接近位于rRNA高级结构域中的特异靶序列，极大地提高了PNA-FISH检测的灵敏性；·PNA探针一般长度为15 bp；

（3）多彩（Multicolor）FISH技术

·近年来，很多学者致力于以不同染色的标记探针和荧光染料同时检测出多个靶序列的研究，最新的多彩FISH技术可以同时用七种染色进行检测；

·应用多彩FISH时，应注意几个问题：

A. 采用多波峰的滤镜；

B. 混合的荧光染料应该具有狭窄的散射峰，以防止探针间光谱重叠，从而去除背景和避免褪色等问题；

C. 在检测低丰度靶序列时，应采用光稳定的高亮度染料；群落监测

（1）监测微生物群落结构与群落动态

·FISH技术多用于分析单个细胞水平上的微生物群落结构，以rDNA为靶点的寡核苷酸探针，可用于原位鉴定单个细胞；

如：《Science》杂志1999年报道了利用FISH技术检测巨大的纳米比亚硫酸盐细菌，直径0.5 mm，是原核生物的100倍·以16S rRNA为靶序列的FISH技术，可用于检测活性污泥微生物群落的种群组成和数量水平。同时，可以对特异菌群进行空间定位和原位生理学分析；

如：在高浓度氨工业废水中，通过16S rRNA为靶序列的FISH 技术证实硝化杆菌类细菌存在于活性污泥中；并且，硝化球菌是优势种群。

·在欧美等国，rRNA测序的群落分析已经广泛应用于监测生

物反应器或废水处理厂的生物相；·应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的FISH技术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种群进行空间分布研究；

（2）FISH技术结合流式细胞仪检测微生物

·是诊断和评价微生物群落结构及其动态的最有前景的技术，是近几年来分析土壤活性污泥等环境样品中微生物分拣和数量的有效手段，适用于对有关微生物群落进行快速和频繁的监测，而且自动化操作水平高；

（3）FISH技术应用时的主要问题

·FISH检测的假阳性可能原因：（a）探针设计不合理；（2）微生物自身荧光的干扰；（c）环境样品（如活性污泥或饮用水等）中天然的可发荧光的生物或化学残留物的干扰；（d）培养基、固定方法和封固剂等对荧光信号强度的影响；

·FISH检测的假阴性

可能原因：（a）细胞壁的结构影响探针的渗透力，导致杂交信号强度降低。革兰氏阳性菌必须进行特殊的固定和前处理，以

提高探针的渗透力；（b）细菌细胞中rRNA含量过低；