基于核酸外切酶I的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg2

基于核酸外切酶I的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg2+

摘要基于富含胸腺嘧啶（T）DNA适配体对Hg2+的特异性识别和核酸外切酶I（Exo Ⅰ）辅助的信号转换策略，

建立了快速检测人尿液中Hg2+的荧光分析方法。固定在微孔

板上的DNA适配体特异识别Hg2+后，折叠成稳定的发卡型

双链结构，不能被单链特异性的Exo Ⅰ水解，核酸染料SYBR Green I（SG）插入发卡部位产生荧光信号，基于此可实现Hg2+的定量检测。优化后的最佳实验条件为：微孔板包被亲和素

浓度为50 mg/L；检测DNA包被浓度为75 nmol/L；使用5 SG 以及1.2 μL的Exo Ⅰ。在最佳实验条件下，体系荧光强度

与Hg2+浓度的对数呈良好线性关系，线性范围为2～500 nmol/L，检出限为 1.5 nmol/L（3σ）。利用本方法检测尿样

中的Hg2+，加标回收率为91.2%～95.0%，相对标准偏差（n=5）为2.1%～4.6%。本方法选择性良好，操作简单，用

HNO3KMnO4溶液将尿液中其它形式的汞氧化为Hg2+后，成功实现了尿液中总汞含量的检测。

关键词DNA识别；核酸外切酶I；汞离子；信号放大；

荧光分析

20160112收稿；20160424接受

本文系国家自然科学基金（No.21506087）资助

Email：flyzhql@

1 引言

汞是一种高毒性重金属元素，可在水、空气和土壤中进

行迁移，并通过食物链进入人体，在肝、肾、脑等器官组织

富集，影响生殖和发育，有致畸、致癌、致突变的作用[1，2]。目前，生物样品中总汞的检测方法主要有原子吸收光谱

[3，4]、原子荧光光谱[5，6]和电感耦合等离子体质谱[7，8]等，这些方法灵敏度和分辨率高，但依赖于大型仪器和专业

的操作人员，样品预处理繁琐，无法满足大批量样本快速筛

查的需求[9，10]。因此，开发准确、灵敏、简便、快速、经

济的汞检测新技术具有非常重要的实用价值。

Hg2+能进入DNA链的胸腺嘧啶（Thymine，T）碱基之间，形成稳定的“THg2+T”结构，基于此人们构建了各种高灵

敏、高特异性的Hg2+荧光传感器[11～13]。与传统的仪器分

析方法比较，核酸作为识别分子的荧光传感方法简便、快速、成本低，尤其适于现场实时检测。但仍然存在检测通量低、

假信号率高、难以直接应用于复杂生物试样[14]等不足。

核酸外切酶I（Exo Ⅰ）是按3′→5′方向，特异性切

割单链的核酸外切酶，对双链DNA及RNA不起作用。许多

研究将Exo Ⅰ应用于核酸探针的信号转变策略，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测[15]。本研究在微孔板上固

定DNA以识别目标分子，采用Exo Ⅰ辅助的信号转换策略，

建立了快速检测尿液中Hg2+的高通量荧光分析新方法。Exo

Ⅰ的使用降低了假信号率，提高了检测的灵敏度。将DNA进行固定后，识别和检测步骤分开进行，有效排除了样品基质

中背景荧光物质的干扰，实现了复杂尿样中Hg2+的荧光分析

检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

SpectraMaxParadigm多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；Fluoro log 321型荧光分光光度计（美国Jobin Yvon 公司）；UV2550 紫外分光光度计（日本岛津公司）；台式冷冻恒温摇床（太仓市实验设备厂）；PHS3C型pH 计（上海雷磁仪器厂）；迷你离心机（德国Eppendorf公司）。

黑色96孔微孔板（康宁公司）；亲和素和牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma 公司）；核酸外切酶I（E. coli Exo Ⅰ，2650A，大连宝生物工程有限公司）；检测DNA 序列（5′

′）由上BiotinGGAGTTGGTTGATTGATTTTTTCTTTCTTCCTTCT 3

海生工生物工程公司合成，用超纯水配成100 μmol/L储备液。实验所用的缓冲溶液（碳酸盐缓冲液：0.5 mol/L

Na2CO3NaHCO3，pH=9.0；PBS缓冲液：0.1 mol/L

Na2HPO4KH2PO4，100 mmol/L NaCl，pH=7.4；PBST缓冲液：0.1 mol/L PBS，pH=7.4， 2 mmol/L MgCl2，0.12% Tween20；结合缓冲液：25 mmol/L TrisHCl，pH=7.4，100 mmol/L NaCl，

（10000×，DMSO）2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl）；SYBR Green I

购自美国Invitrogen 公司，使用前用结合缓冲液稀释100倍（100×工作液）；0.5 mmol/L汞标准溶液的配制参见文献[16]，用结合缓冲液稀释成不同浓度。用经酸处理的具塞聚乙烯塑

料瓶收集一次尿样，尽快测定比重，置于4℃保存；其它试

剂为分析纯。实验用水为MilliQ超纯水（18.2 MΩ?cm，美

国Millipore公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 包被亲和素亲和素用碳酸盐缓冲液稀释成适当

浓度，包被微孔板（100 μL/孔），4℃放置12 h后，用PBST 缓冲溶液清洗。最后用1% BSA 封闭1 h，PBST洗涤3次。

2.2.2 DNA在微孔板上的固定亲和素包被的微孔板中，

每孔加入100 μL 检测DNA的PBS溶液，37℃摇床摇振反

应2 h，通过DNA 5′端的生物素和亲和素的特异相互作用，

DNA固定到亲和素包被的微孔板上。PBST洗涤3次，200 μ

L/孔。然后加1% BSA封闭1 h，PBST洗涤3次。包被的DNA 微孔板立即用于下步测试。

2.2.3 Hg2+的定量检测（1）DNA识别反应Hg2+标准溶

液用结合缓冲液稀释成系列浓度，分别加入到包被检测DNA 的微孔板中，每孔100 μL，室温孵育40 min使DNA和Hg2+充分反应。接着在每孔中加入 1.2 μL Exo Ⅰ（5 U/μL）和

11 μL 10×Exo Ⅰ缓冲液，37℃孵育30 min；倾去反应液，

用PBST缓冲液洗涤3次，200 μL/孔。（2）荧光测定在