二代测序原理与技术(IonProton)

Criteria 测序原理
电位检测原理
Proton
单端测序读长 200bp（还有提升空间）
数据准确性
单次测序原始数据准确性99.9%
实验时间 数据通量
1天
PI 芯片： 8-16G(2个RNA样本即可开机测序) PII 芯片 ：32-64G
Hiseq 2000
光学检测原理
100bp
Hiseq2000公开的招标参数上描述单次测 序原始数据准确性为99.9% 慢速模式：11天 快速模式：40小时 慢速模式：300G(60个RNA样本即可开机) 快速模式：最高120G
Ion Proton™ Sequencer ——基研生物国内率先引进二代半测序平台
1 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
Ion Proton System的测序原理 Ion Proton System
2 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
19 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
基因芯片
二代测序与芯片技术的比较
每个小格是一簇长度 为60bp长度探针，每 个探针鉴定一个基因 的表达很亮，如果一 个基因表达量高，那 么该小格所释放的荧 光强度越高。
芯片就是测序仪
-----后光学原理
半导体测序 扩展迅速、反应灵敏
符合半导体行业摩尔定律 通用试剂与测序芯片自由组合
测序速度快
最快12小时测序时间
3 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
Ion PI™ 芯片适用于全外显子组或全转录组测序 Ion PII™ 芯片适用于人类全基因组测序
6.读取模版的连续两个相同碱基
13 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
7.芯片上几十万、几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息
14 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
7.芯片上几十万、几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息
15 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点 Ion Proton System的特点
16 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
Per sequence quality scores
新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点
Mapping 率分析统计结果
24 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
数据后期处理 新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点
Ion PI™ Chip
165 M wells
10 Gb for 2 Exomes
目前实测：60-80M Filtered Reads
4 hours
Ion PII™ Chip
660 M wells 20X human genome 目前实测：240-320M
Filtered Reads Runs in Hours
该基因外显子长度
Mapping回referece序列的reads数量
26 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
差异可变剪接筛选
可变剪接方式1 可变剪接方式2
27 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
6 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
芯片示意图
7 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
1.依次掺入四种碱基
8 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
高通量芯片内进行测序反应
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
4种dNTP依次流过Ion芯片 DNA 聚合反应产生的氢离子的直接检测 每个碱基的检测只需要几秒
25 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
RPKM
RPKM (Reads Per Kilo bases per Million reads)
Mapping回reference序列的reads数量
RPKM=
Total Exon Reads Exon Length X Mapped Reads(million)
测序流程介绍
制备测 序文库
油包水 相扩增
收集纯 化磁珠
上机测序
数据分析
2小时
5小时
12小时
测序速度快，随到随测
18 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
0.5小时
Ion Proton与Hiseq2000技术指标比较
（Reads）。
一个基因表达量 越高，该基因测 到的Reads数量 也越多。
一条Reads
21 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
100bp
新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点 数据处理
22 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
一条基因
一根探针 60bp
整个基因中，仅以与这60bp探针互补杂 交到的基因表达量来代表整个基因的表 达量。
20 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
二代测序
二代测序与芯片技术的比较
一条基因
通过测序技术直接获 得这些基因的序列片
一天之内完成从样本制备到测序数据产生全部流程
Ion Kits
Ion Proton™ OneTouch 2 System
Ion Proton™ Sequencer Proton™ Torrent Server
17 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
2.碱基配对结合
9 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
3.释放氢离子
10 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
4.读取模版碱基
11 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
5.连续两个相同碱基结合
12 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
Raw Data预处理
源自文库
去接头
去除低质 量序列
随机
Blast
去除过 短片段
去除PCR-
Duplication
初步 过滤
在Mapping之前得到干净的Reads
23 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
数据后期处理
4 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
测序原理简单----后光学原理 直接检测氢离子，无需荧光检测
5 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
可变剪接示意图
Experiment 1
Experiment 2
Isoform1 Isoform2
28 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
Exp1 Exp2
Thank You!
29 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential