肿瘤体外药敏检测

☆

肿瘤化疗药敏方法发展及简介
化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然 某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别 是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及 多重耐药性（MDR）等因素有关。 因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为 化疗界所关注的问题。 早在上世纪 60年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检 测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发 展成为体外（ in vitro ）与体内（ in vivo ）两类，成为 “当今癌症研究的主攻课题”之一。
20 0
ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0016
传统化疗(n = 17)
传统化疗(n = 17)
0 50 100 150 200 250
100
150
200
250
Weeks
Weeks
引自Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-57
肿瘤体外药敏检测技术进展及应用
☆ 肿瘤化疗药物敏感性试验 是个体化治疗的基础

肿瘤化疗药物敏感性试验(TCA)
Tumor Chemosensitivity Assay
将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后 通过检测细胞活性的有关指标，判断不同 药物的疗效。通过这种试验，即可确定针 对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物 或药物组合。
wk.baidu.com
（四）瘤细胞连续培养

瘤细胞培养一定时间后（通常为1～4周），细胞生长增殖 达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞， 进行传代培养，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量 多，在抗癌新药筛选中起重要作用。 缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。

二、体内药敏检测

即异种移植法。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标 本移植于受试动物体内如肾包膜下移植法（SRCA） ， 再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大 小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体 情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的 环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床 意义较大。 体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞 植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。
药敏检测方法 存在问题
标本可评价率低，仅有40~70％。 实验周期长，需要2周以上 测试药物种类和数量有限 操作繁琐，难以标准化 阳性预测值较低，仅有40～60％ 敏感性较差，最低仅能检测500个细胞 量程较小，有效量程在2.0以内 可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤 人为判断因素较大，难以推广 标本可评价率不高，仅有70～80％ 阳性预测值较低，仅有70～80％ 实验人员接触放射，不利于健康 标本可评价率不高，仅有70～80％ 测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞 对某些药物的测试结果存在假阴性


一、体外药敏检测
理想的药敏检测方法应该具备的条件
1. 操作简便，可以标准化，便于推广 2. 标本可评价率高 3. 检测敏感、可靠、客观 4. 临床相关性
肿瘤化疗药敏方法发展创新方向
1. 标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）
2. 对体内环境的极近模拟
（一）瘤细胞直接损害试验
新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触 1～数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未 加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判 断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的 不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶 橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周 期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已 少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。
集落形成法 （HTCA）
四唑蓝比色法 (MTT)
细胞毒性差异染 色法 (DiSC)
胸腺嘧啶核苷 掺入法 (3HTdR)
原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示

本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无 完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。 肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流 式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再 作为独立的药敏检测方法。

（二）原代瘤细胞培养

体外药敏预测一般采用短期原代培养。在无菌条件下，用机 械法和／或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞 团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定）， 与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算 用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。
主要的原代瘤细胞培养药敏检测方法 及其存在的问题
传统化疗和ATP-TCA指导的化疗的 生存率比较
100 80 100 80 ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0009
Overall Survival
% Patients
Progression free Survival
% Patients
60 40 20 0 0 50
60
40


一些相对简便经济的方法在目前仍应积极提倡，如MTT比 色法。
（三）同步瘤细胞培养

将处于不同细胞周期的瘤细胞分离培养，可研究 药物的周期特异性作用。
1.药物阻断法 如长春新碱使细胞阻滞于M期，博莱霉素 则使其堆积于G2期。 2.物理法 运用细胞同步化技术，如M期细胞震荡收集 法，可避免药物阻断法的干扰作用。
左：肠型腺癌(胃)
右：弥漫型胃癌
2.临床与个体化治疗

化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中 具有不可替代的地位。
同种肿瘤对化疗药物具有不同的反应性，忽视个体 差异仅凭经验式化疗存在盲目性，使得总体疗效不 佳。尤其对实体瘤，经验化疗的疗效仅为20％左右。


临床需要切实可行的检测方法，在用药前筛选出敏 感药物，以进行针对性较强的个体化治疗；是否进 行个体化治疗成为肿瘤化疗能否成功的关键因素。
1.肿瘤细胞的异质性(heterogeneity)

肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特点，而同一种肿瘤的基 因特性和发生阶段都可能会有非常大的差别；表现出在形态 上和生物学功能上的极大的不同。 这种肿瘤细胞的异质性已经得到越来越清楚的认识。
肿瘤细胞的异质性主要表现在 形态异质性：病理学上的形态多种多样。 基因异质性：肿瘤的发生经历了多基因的改变，同一种基 因可以有多个突变位点。如P53基因的突变 位点就已发现有 2000个之多。 功能异质性：基因的异质性导致生物学功能的异质性。