小鼠灌注取脑

灌流取脑

大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500ml、500ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。

小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20ml/分钟。

时,剪开右心耳,使血液排出。

观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。

固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项：1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。

首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

小鼠缺血再灌注

小鼠缺血再灌注（实用版）目录1.小鼠缺血再灌注的背景和意义2.小鼠缺血再灌注的实验方法和操作步骤3.小鼠缺血再灌注的实验结果和分析4.小鼠缺血再灌注的结论和展望正文一、小鼠缺血再灌注的背景和意义小鼠缺血再灌注是指在小鼠体内某一部位发生缺血后，再通过灌注使其恢复血流。

这一过程在生物医学研究中具有重要意义，因为它可以模拟人类某些疾病的发生过程，如心肌梗死、脑卒中等。

通过研究小鼠缺血再灌注，可以深入了解缺血后再灌注对组织和器官的影响，为临床治疗提供理论依据。

二、小鼠缺血再灌注的实验方法和操作步骤1.实验动物选择：选用健康成年小鼠，分为实验组和对照组。

2.制备缺血模型：将实验组小鼠放入灌注装置中，通过调整灌注流量和时间，使小鼠某一部位（如心肌、脑组织等）发生缺血。

3.观察缺血程度：通过检测相关生理指标（如心率、血压、血氧饱和度等），评估小鼠缺血程度。

4.再灌注操作：在观察到缺血程度达到预设值后，恢复灌注流量，使缺血部位重新获得血流。

5.观察再灌注效果：通过检测生理指标，评估再灌注对小鼠的影响。

三、小鼠缺血再灌注的实验结果和分析实验结果显示，在缺血发生后，小鼠的心率、血压、血氧饱和度等指标会发生明显变化。

再灌注后，这些指标会逐渐恢复到正常水平。

但不同缺血时间和程度的小鼠，再灌注后的恢复情况有所不同。

通过对实验结果的分析，可以得出以下结论：1.缺血再灌注对小鼠的组织和器官具有一定的保护作用，能够减轻缺血带来的损伤。

2.缺血时间和程度的不同，再灌注的效果有所差异，提示再灌注治疗需要个体化。

四、小鼠缺血再灌注的结论和展望总之，小鼠缺血再灌注实验为研究缺血后再灌注的生物学效应提供了一个有效模型。

通过对这一模型的深入研究，可以为临床治疗缺血性疾病提供理论依据和技术支持。

小鼠脑缺血再灌注损伤药理实验研究技术路线图

Western blot 检测
Bax 、 Bcl-2 、
CytC
、
Caspase-9 、
Caspase-3 、
PARP-1 蛋白表达
小鼠脑缺血ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ灌注损伤药理实验研究技术路线图
ICR 小鼠 (雄 ) 性） (xuxing
空白对照组：假手术组
局灶性脑缺血损伤模型组
模型+阳性药物（×××）组
模型+ ×× ×（高、中、低剂量）组
连续给予受试药物 5天
线栓法复制大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性脑缺血损伤模型：缺血 2h，再灌注 24h（缺血前 1h 给药一次，再灌注后 12h 再给药一次）依 Bederson 法进行神经功能缺陷评分
取缺血区脑组织检测
1、T TC 染色法测定脑梗死面积 2、干湿重法检测脑水肿程度 3、 HE 染色法进行组织病理学观察
1 、分光光度法检测 Caspase-3 活性 2 、原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡 3 、免疫荧光法测定 Bax 、 Bcl-2 、 Caspase-3、Cyt C 阳性细胞数目

小鼠缺血再灌注

小鼠缺血再灌注
小鼠缺血再灌注（I/R）是一种实验模型，用于研究组织缺血引起的损伤以及血液再灌注对损伤的影响。

这一模型通常用于心血管疾病、脑卒中、肝脏和肾脏等器官的研究。

操作步骤通常包括以下几个阶段：
1.缺血阶段：通过暂时封闭（结扎）或阻断（通过其他方法）血
管，以模拟组织缺血。

这可以在不同的器官中进行，比如通过
结扎冠状动脉来模拟心肌缺血，或者结扎肾动脉来模拟肾脏缺
血。

2.再灌注阶段：在一定时间后，重新开通或恢复血液供应，模拟
组织再灌注。

这一步骤旨在模拟血流的恢复，但在一些情况下，
再灌注本身也可能导致组织损伤。

3.取样和分析：小鼠通常在不同的时间点被处死，组织样本被取
出以进行各种生化、组织学和分子生物学分析，以评估缺血再
灌注对组织的影响。

小鼠缺血再灌注模型可以用于研究相关疾病的机制、开发治疗策略以及评估药物的疗效。

例如，这个模型可以用于研究心肌梗死、脑卒中、肾功能损伤等疾病。

在进行这种类型的实验时，需要确保符合伦理和动物福利的要求，并遵循实验室和国家的相关规定和指南。

研究人员应该采取适当的措施来减少动物的痛苦和苦恼。

小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作

小鼠PCR基因鉴定一、取材：小鼠出生后3-4周，给小鼠打耳标，并依照雌雄分笼饲养，需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘，放置好在印管中，并做好相应的标志，放置标本与标志混乱。

处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中，在98℃孔板中煮1小时（2）取出印管后，再加入B液75 μl二、扩增1.反应体系 Mix 5μlH20 3μlPrimer1 0.5mlPrimer2 0.5ml2.加样先计算出所需总量，加入印管中，混合均匀，离心，摆放好单个PCR管，将上述混合液放入PCR仪，每管9 μl盖紧。

3.扩增打开PCR仪并设置好程序，将PCR管放入PCR仪，扩增，40多分钟可以完成。

4.保存扩增后，取出PCR管，放入冰中保存。

三、琼脂糖凝胶电泳1.制胶：电子天平称取计算后的琼脂糖，小心倒入干净的锥形瓶内（锥形瓶内保持干净）。

加入TAE缓冲液，盖上锡箔纸，加热。

取制胶模具、梳子，安装固定，保证不会漏胶。

戴上手套，取出锥形瓶，掀开锡箔纸，冷却3-4分钟，加入染色剂，贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液，若有气泡。

室温放置凝固。

2.上样：胶凝固后，双手缓慢垂直地拔出梳子，避免破坏梳孔。

将胶板放上电泳槽，注意正负极变化，加入1×TAE缓冲液，从胶表面开始缓慢倒入，自然流向两边，然后依次对孔加入对应的DNA样品，剩余样品放入冰箱储存。

3.电泳：合上电泳槽，正负极对好，检查底部是否有气泡升起。

有气泡则电泳开始。

4.成像：观察是否出现条带，若出现条带，则停止电泳，打开凝胶成像系统，对结果进行比对、记录并拍照。

关闭系统，登记实验记录，取出胶并清洗仪器器材。

鼠灌注取脑1、麻醉：根据鼠的体型、重量适量注射麻醉剂，腹腔注射，用手套防止被鼠抓伤，虎口卡住颈部肌肉及其周围肌肉，注射药物时反推针筒活塞以防有空气，针头针刺入鼠腹腔注射药物后，并放回笼中，等待药物起效。

2、开胸：找到剑突，用弯剪在剑突附近把毛剪干净，露出表层皮肤，再沿肋弓朝两边剪开，注意深度，别剪到心脏，待心脏暴露出后，仔细剔除神经，剪掉心包膜，用镊子夹持剑突并将其连胸廓上翻固定，使心脏充分暴露。

取小鼠脑组织

取小鼠脑组织丁香园上面总结的方法，排版有点乱。

其实过程与大鼠近似，我的经验是：1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2. 步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。

3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。

先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。

具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。

然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。

用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。

生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。

然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。

取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。

成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤
实验步骤：
1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。

用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。

2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。

灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。

3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。

整个PFA灌流时间约为5min。

（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。

将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。

取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。

将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。

需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。

2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。

3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。

4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。

5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。

此时可将脑取出进行冷冻切片。

电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2gp91phox表达的影响

电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2/gp91phox表达的影响曾超，陈静，刘文兵,李辉，王静,马睿杰(浙江中医药大学附属第三医院•浙江杭州310012)摘要目的:探讨电针对脑缺血再灌注(I/R)损伤后的神经保护机制，明确电针对脑损伤后氧化应激的抑制作用。

方法:采用小鼠大脑中动脉闭塞模型制备脑局灶性缺血1h再灌注3,24,48h模型。

每组又分为模型组、电针组、药物组、gp91phox基因敲除组(下文简称基因组)，另设同时段假手术组。

以神经功能缺损评分和局灶脑血流(rCBF)变化为造模成功和效应指标，并RT-PCR检测NOX2/gp91phox基因在小鼠脑组织的表达情况，光泽精增强发光法检测NOX活性。

结果:①神经行为学评分：造模各组均有不同程度的缺损表现，再灌注即刻缺损情况较再灌注干预后严重，基因组灌注即刻评分明显低于模型组(P<0.05)，与模型组比较,灌注后3、24、48h基因组、药物组、电针组神经行为学评分均明显降低(P<0.05)。

②rCBF：各造模组rCBF明显减少，灌注后3、24、48h各组rCBF均有增加，药物、电针组比模型组升高明显(P<0.05)。

③NOX活性:模型组各时相之间无明显差异，基因组NOX活性无明显表达(P<0.01),药物组、电针组比模型组的同时相均有明显下降(P<0.01),药物和电针组的组间比较无明显差异。

④NOX2/gp91phox基因表达:模型组各时相之间无明显差异，基因组无蛋白表达，与各组比较均有显著差异(P<0.01),药物组、电针组比模型组的同时相均有明显下降(P<0.01),药物组和电针组的组间比较无明显差异。

结论:通过与敲除gp91phox基因组的小鼠相比较，电针"百会""大椎"穴位可以通过抑制NOX2/gp91phox表达，达到抑制I/R后小鼠的氧化应激损伤效果，发挥保护脑组织的作用。

小鼠脑立体定向注射细胞步骤

小鼠脑立体定向注射细胞步骤
小鼠脑立体定向注射细胞是一种将细胞悬液注入小鼠脑特定区域的方法，用于研究细胞在脑内的功能和行为。

下面是小鼠脑立体定向注射细胞的一般步骤：
1. 麻醉小鼠：使用适当的麻醉药物使小鼠进入麻醉状态，例如地西泮等。

2. 固定小鼠头部：将小鼠的头部固定在稳定的位置上，例如使用头架。

3. 打开头骨：通过小鼠头顶处的切口和钻孔将头骨暴露出来。

4. 确定注射位置：使用显微镜或立体定向仪来确定注射位置，通常是根据已知的脑解剖学结构和坐标进行确定。

5. 钻孔：使用细钻在确定的注射位置上钻孔，直径通常为0.5-1mm。

6. 注射细胞悬液：使用微量注射泵或注射器将细胞悬液缓慢注射至目标区域，注射速度通常为0.1-0.5μL/min。

7. 拔针和关闭钻孔：注射完成后，缓慢拔出注射针，并使用适当的材料关闭钻孔。

8. 缝合伤口：使用缝合线或伤口闭合剂缝合切口。

9. 观察恢复：将小鼠转移到恢复的环境中，观察其恢复情况。

10. 后续处理：根据实验需求，可以进行进一步的行为测试、组织切片等后续处理。

需要注意的是，小鼠脑立体定向注射细胞是一项复杂的技术操作，需要经过专业的培训和实践才能够熟练进行。

同时，实施过程中需要遵守实验动物伦理规范，确保动物的福利和实验的科学性。

小鼠脑腔注射操作流程

小鼠脑腔注射操作流程
麻醉：首先，需要对小鼠进行麻醉。

这通常可以通过使用异氟烷气体麻醉，将小鼠放入预麻箱，调节高气流量和麻醉浓度（约4LPM, 5%），小鼠1分钟内进入深麻状态。

固定：麻醉后，将小鼠固定在立体定位仪上。

选择带有定位仪专用气体麻醉面罩的小鼠适配器，将小鼠的门齿扣置于适配器，轻压鼻梁，前后移动适配器，使左右两侧耳杆中心线与小鼠外耳道位于同一直线上，然后将左、右耳杆分别推入外耳道，调节两耳杆位置中心对称、且高度一致，螺丝锁紧固定耳杆。

定位：根据脑图谱，确定待注射脑区的位置参数，包含离 Bregma 和 Lambda 点的距离以及核团深度。

钻孔：在预定的注射位置处，用颅骨钻打开一个小孔。

小心地用颅骨钻在注射位点处轻磨颅骨，将颅骨慢慢打薄，当颅骨出现裂缝的时候，用医用注射器的针头小心挑破，防止损伤。

注射：使用微量注射器，将药物或其他试剂缓慢地注入到脑腔中。

将微量注射器的33 G钝针穿过预穿孔并进入视网膜下腔，直到感觉到轻度阻力的点为止。

恢复：注射完成后，将小鼠放回笼中，继续饲养并观察其状态。

小鼠大脑中动脉阻塞模型制备的经验总结

小鼠大脑中动脉阻塞模型制备的经验总结缺血性脑血管疾病严重危害人类身体健康和生活质量，其发病预见性差、治疗时间窗短、复发率高，且往往会留下明显的后遗症。

脑缺血后经积极治疗脑血管可恢复再通，但也会导致重新获得血液供应的脑组织区域的损伤和机体功能障碍，即脑缺血再灌注损伤。

当前对于脑缺血再灌注损伤发病及治疗相关的神经学、病理生理学、药理学等研究日渐深入，而制备能精确模拟人脑缺血及缺血后再灌注的动物实验模型是上述实验研究的基础。

本文就目前国内外医学界普遍采用的线栓法小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，结合作者多年的MCAO模型制备经验，作如下总结介绍。

1.实验前期准备：雄性小鼠（体重20-25g）、3.5%水合氯醛、碘伏、3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、冰冻切片包埋剂、小鼠脑切片模具、显微镊、显微剪、血管夹、手术缝合线、鱼线。

2.线栓的制备：在制备模型前，需首先制作适宜长度和内径的线栓，经过多次实验，笔者发现用直径0.15mm、长度15mm的鱼线制作线栓，阻塞小鼠大脑中动脉效果最好。

取固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化，将直径为鱼线的一端垂直浸润到熔化的石蜡中再迅速提起，石蜡凝固后可牢固地粘附在鱼线的一端，在鱼线15mm的位置处作一标记，线栓即制备完成。

3.MCAO模型的制备：小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，麻醉后固定小鼠，碘伏消毒，颈部做切口。

从颈部切口中找到左侧颈总动脉（CCA），继续向上分离颈外动脉（ECA），结扎其各分支动脉血管，ECA残端结扎挂线，沿线轻轻提拉游离出ECA。

根据ECA位置在其斜下方找到颈内动脉（ICA），仔细分离并确定ICA的正确血管走向，之后用血管夹夹闭ICA远心端和CCA近心端，用细线结扎并在ECA起始端上打一活结。

在ECA靠近CCA部分剪小口，插入事先制备好的线栓，同时夹闭翼腭动脉（PPA），继续推进线栓。

待插入线栓约15mm时，会微遇阻力（此时小鼠出现略微挣扎现象），此时线栓头端正好插入MCA，将预先置于ECA起始端的细线扎紧，缝合颈部切口，碘伏消毒。

血脑屏障神经血管单元细胞分离

血脑屏障神经血管单元细胞分离
血脑屏障是一种特殊的生物屏障，位于脑血管和神经细胞之间。

它主要由神经血管单元细胞组成，包括脑血管内皮细胞、血脑屏障基底膜、脑管周围细胞和血脑屏障内胚窦细胞等。

分离血脑屏障神经血管单元细胞的方法有多种，以下是常用的几种方法：
1. 静脉灌注法：将动物（如小鼠）的心脏暴露出来，通过心脏灌注的方式将灌注液（包含胶原酶和DNA酶等）注入动脉，使灌注液通过全身循环进入脑血管，并附着在脑血管内皮细胞表面。

随后，使用玻璃胶片或刮刀轻轻剥离脑血管内皮细胞，并进行进一步培养和分离。

2. 高纯度密度梯度离心：利用密度梯度离心技术，分离出富集的脑血管内皮细胞。

首先，将动物大脑切片加入含有不同密度的葡萄糖或离子胶体溶液中，然后进行离心，使不同细胞组分在密度梯度中分层。

随后，通过收集不同密度梯度中特定层次的细胞来获取纯化的脑血管内皮细胞。

3. 免疫磁珠法：利用免疫磁珠分离技术，结合特定的抗体和磁珠，可以选择性地捕获和富集脑血管内皮细胞。

通过与细胞表面标志物反应的抗体结合，然后利用磁力将靶细胞捕获并分离出来。

这些方法可以根据需要进行适当的改进和调整，以满足不同实验的要求。

分离脑血管内皮细胞后，可以用于研究血脑屏障的功能、细胞交互作用以及相关疾病的发生机制。

小鼠前脑缺血灌注损伤模型海马CA1区的形态学观察

ａｒｅａ
ｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅｍｅｄｙｆｏｒ
ａｆｔｅｒｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ．ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．
ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉｘｇｒｏｕｐｓ：ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎ
ｍｉｎ后静推甘露醇。实验小鼠再灌注２４ｈ后取脑，固定切片，ＨＥ染色，对照观察海马ＣＡｌ区细胞损伤程度，筛选脑缺血再灌注损伤形成变性神经元的合适缺血时间，为选取合适的实验平台提供依据；观察缺血后脱水治疗对变性神经元形态的影响，评价模型用于缺血再灌注后干预实验的可用性。结果：两动脉阻断法建立小鼠前脑缺血再灌注损伤模型，再灌注时间定为２４ｈ，随缺
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｉｘｔｙｍｉｃｅ
ｇｒｏｕｐ（Ａ），
ｉｓｃｈｅｍｉａｆｏｒ３０ｍｉｎ（Ｂ），６０ｍｉｎ（Ｃ），９０ｍｉｎ（Ｄ），１２０ｍｉｎ（Ｅ）ｇｒｏｕｐｓ，ｍａｎｎｉｔｏｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ
（Ｆ）．Ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｗａｓｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ
ｎｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐＦａｎｄＡ（Ｐａｖｅｒａｇｅ＞０．０５）．
ｎｅｕｒｏｎｓ
ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＡ，ｔｈｅ
Ｃ，Ｄ
ｄｅｎａｔｕｒｅｄ
ｒａｔｅｓｏｆ
ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡｌ
Ｆｉｓｌｅｓｓ
ａｒｅａ
ｉｎｇｒｏｕｐｓＢ，ａｖｅｒａｇｅ＜
山西医科人学硕士学位论文
小鼠前脑缺血再灌注损伤模型海马ＣＡｌ区的形态学观察
摘要
目的：探索以变性神经元为观察对象，适用于脑缺血再灌注后干预实验的动物模型。方法：６０只小鼠随机分为６组：假手术组（Ａ组），缺血３０

组织灌流固定技术

动物灌注固定一、准备1、手术器械一套（可不高压消毒）、针头2、试剂瓶三个，烧杯一个，漏斗、磁力搅拌子一个3、所有进入老鼠体内的液体都要过滤二、方法1、提前配制4％多聚甲醛（称量4g，放置于100ml 0.1M PB中，55度加热搅拌至充分溶解，搅拌子速度从低到高，慢慢增加，滤纸过滤，4度保存）、温生理盐水或PBS（滤纸过滤，40ml/只或快速滴5min，流出液变白即可，盐水过多细胞死亡多）；2、装好多聚甲醛、温生理盐水吊瓶，排空气泡，确保一定液体压力。

10％水合氯醛麻醉（20g 小鼠约0.2ml；大鼠：10％0.3ml/100g ; 4％1ml/100g; 7％0.5ml/100g），反向固定好老鼠；3、沿腹腔打开老鼠的胸腔，充分显露心脏（插针）和肝脏（判断），尽可能多暴露心脏，利于操作，进液。

4、找到鼠心尖，用止血钳（选把好的很关键）预夹住心尖少部，持针从心尖略偏左下进，插入有突破感即停（小鼠室壁厚约1mm），打开生理盐水的输液器。

大鼠直接进到主动脉内。

5、若正确进入，右房充盈，剪破右房，此时液体较快下滴（调整针头朝向），红色血液从右房流出，快速冲尽全身血液（否则影响免疫反应），时间约4－5min，40ml/只小鼠，80ml/只大鼠。

（取水冲洗切口，防血液凝固）正确进入指标：右房充盈（但不是迅速充盈－此示针进右房），肝脏逐渐变白，口鼻干燥4、换4％多聚甲醛灌注30min左右。

多聚甲醛要偏快。

100ml/只小鼠，200ml/只大鼠用灌注机：先排空管中空气，再行灌注灌注正确标准：换多聚甲醛后身体反应，尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。

5、取脑组织，正确脑变白，无红色血管。

继续后固定12h，沉糖切片。

如不立即切片，可保存高压灭菌PB中。

注意：1、心脏很脆，尽量一次成功，不要反复卡紧——松开，心脏破了就失败了。

2、进针偏右，进到右室：肺水肿；进针太深，进到左房：左房大，肺水肿取材：一、准备：1、提取蛋白：碾磨器、EP管、培养皿、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、组织冻存管（高压，标记）、一次性手套、口罩、冰盆2、提取核酸：见前面二、方法：3、鼠内脏：心、肝、脾、胰腺、肾、肾上腺、睾丸－卵巢（雌鼠Y形上端；雄鼠Y形下方）、胸腺、膀胱4、鼠脑：皮质、海马、纹状体、小脑、下丘脑、垂体、脑室周围区、脊髓一半全脑。

取小鼠脑组织完整版

取小鼠脑组织HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】丁香园上面总结的方法，排版有点乱。

其实过程与大鼠近似，我的经验是：1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2.?步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。

3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。

先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。

具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。

然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。

用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。

生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。

然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。

取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。

灌流取脑的原理-概述说明以及解释

灌流取脑的原理-概述说明以及解释1.引言1.1 概述灌流取脑是一种用于实验室动物的神经科学研究中的常用技术。

该技术的原理是通过将药物或其他物质直接注入动物的脑组织中，以模拟特定疾病或研究特定神经通路的功能和调控机制。

灌流取脑技术可以帮助科研人员更好地理解神经系统的结构和功能，探索与神经相关的疾病的发病机制，并寻找新的治疗方法。

本文将对灌流取脑技术的定义、原理和应用进行详细解析，以期为神经科学领域的研究和发展提供有益的参考。

1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。

在引言部分，将对灌流取脑的概述进行介绍，包括其定义、背景和目的。

通过引入相关背景知识，引出本文的研究重点和意义。

在正文部分，将进一步展开对灌流取脑的定义和背景进行深入分析，探讨其原理解析和应用领域。

通过对灌流取脑的原理解析，读者可以更清晰地了解其工作机制和实现原理；同时，探讨其应用领域，展示其在实际生活中的重要性和应用前景。

在结论部分，将对整篇文章进行总结，强调灌流取脑的重要性，并展望其未来发展方向。

通过对灌流取脑的未来发展进行展望，可以为读者提供更具体的参考意见和思考方向，为相关研究和实践提供指导。

最后，通过结束语，对整篇文章进行总结，并为读者留下深刻印象和思考。

1.3 目的本文的目的在于探讨灌流取脑技术的原理，并分析其在不同领域的应用潜力。

通过深入剖析灌流取脑的工作机制，我们可以更好地理解其在神经科学领域的重要性和意义。

此外，对于该技术未来的发展趋势和可能的应用场景进行展望，有助于启发更多相关领域的研究和创新。

最终，希望能够为读者提供全面的信息，促进灌流取脑技术在科学研究和医学实践中的广泛应用。

2.正文2.1 灌流取脑的定义和背景灌流取脑是一种特殊的技术手段，用于在动物实验或医学研究中获取活体动物的脑组织。

通过将药物或缓冲液注入动物的血管系统，可以使脑组织保持生物活性，以进行进一步的实验或研究。

这种技术起源于20世纪初期的生物医学研究中，主要用于研究神经系统、药物作用等方面。

灌注取脑实验报告

一、实验目的1. 掌握动物解剖技术，熟悉小鼠心脏灌流及取脑的方法。

2. 了解脑组织在生理学、病理学等研究中的重要性。

3. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。

二、实验原理灌注取脑实验是研究脑组织生理、生化及病理变化的重要方法。

通过心脏灌流，将生理盐水或特定试剂注入动物体内，达到清除脑组织中的血液、细胞等杂质，便于后续实验研究。

本实验采用小鼠作为实验动物，通过心脏灌流及取脑，获取脑组织样本。

三、实验材料1. 实验动物：成年小鼠2. 仪器：解剖显微镜、手术器械、灌流装置、剪刀、镊子、注射器、注射针、泡沫板、生理盐水、固定液等3. 药品：戊巴比妥钠、肾上腺素、生理盐水、固定液等四、实验步骤1. 麻醉：将小鼠放入戊巴比妥钠溶液中，待小鼠失去意识后，立即用针头固定在泡沫板上。

2. 解剖：扯起小鼠胸部皮肤，用剪刀剪开胸部肌肉，暴露心脏。

3. 心脏灌流：用注射针连接灌流装置，将生理盐水注入小鼠心脏，使血液流向脑部。

4. 取脑：待生理盐水灌流完成后，将小鼠头部朝下，用剪刀剪开颅骨，暴露脑组织。

5. 固定：将脑组织取出，放入固定液中固定，以便后续实验研究。

6. 清洗：将固定好的脑组织用生理盐水清洗，去除杂质。

7. 标本保存：将清洗后的脑组织放入装有固定液的容器中，密封保存。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过心脏灌流及取脑，成功获取了小鼠脑组织样本。

2. 结果分析：本次实验操作规范，脑组织样本质量良好，为后续实验研究提供了有力支持。

六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免损伤脑组织。

2. 灌流速度不宜过快，以免损伤脑组织。

3. 固定液的选择对脑组织样本质量有重要影响，应选用合适的固定液。

4. 实验过程中，应注意动物福利，尽量避免动物痛苦。

七、实验总结本次实验成功进行了小鼠心脏灌流及取脑操作，掌握了动物解剖技术，为后续实验研究奠定了基础。

在实验过程中，我们应注重操作规范，确保实验结果的准确性。

同时，本次实验也使我们认识到动物福利的重要性，为今后实验研究提供了有益经验。

小鼠脑定位注射资料讲解

小鼠脑定位注射精品文档小鼠脑定位注射protocol实验器材和用具：剃头刀，伤口缝合剪，定位仪扳手，双氧水，酒精，碘酒，棉签，镊子，镊子剪，病毒，0.01MPBS,人造眼泪，抗生素，电热毯实验准备：PBS将针头针筒清洗两遍，Protocol：1.1%戊巴比妥钠(85.7mg/公斤)将小鼠麻醉;2.头顶部去毛，然后给小鼠眼睛抹上人工眼泪；3.将其头部固定于定位仪上，上颚牙齿挂到定位仪上，旋动头部螺旋使其刚好压住老鼠的鼻子，将两侧小棒插入到小鼠双耳中，约7格,使其头部稳定；4.消毒，碘酒擦拭，然后用酒精擦，共三遍；5.用手术刀从头部中央划开一个小口，用镊子剪将伤口剪大；6.用伤口夹将伤口处皮肤拉向两侧，3%的双氧水将筋膜去除，找到bregma，lambda两点，通过头部固定螺旋使bregma，lambda两点高度一致；7.定点：距bregma点3mm处为第一点，分别向两侧2.6mm用染料定两点，定位仪向前移1mm，距bregma点2mm处定第二点，分别向两侧1.6mm用染料定另外两点，如右图；8.电钻打孔；9.注射：先抽取4µL的PBS，然后抽0.5µL的空气，最后抽取4µL病毒，W为吸，I为注射，注射速度为500nl/min；10.将注射针固定于定位仪上，小心将针头下降至头颅钻孔水平面，若从针尖算：前两个点为插入3mm，后两个点为 3.5mm；若从斜面刚进入脑颅中算起：前两个点为2mm，后两个为2.5mm；11.病毒注射完后，要将其静止3分钟后，慢慢将针头退出,以便病毒很好的被吸收，四个孔均如此；12.注射完后，用两个PBS棉签将针头上的血迹清理干净，避免针头弯曲，用乙醇反复清洗针筒十次；13.用捏子将伤口两侧皮肤扯到一块，用缝合剪缝好，敷上抗生素，将小鼠放在热毯上，便于苏醒；14.将所用手术器械用酒精擦拭干净，柜台内收拾干净，处理好垃圾，UV照射三十分钟。

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小鼠脑组织病理总结

切片
• 石蜡：冷水——温水（54°-56°）—— 石蜡：冷水温水（ ° ° 温水烤片（ ° 烤片（80°）切好烤片后可以室温保存。切好烤片后可以室温保存。 • 冰冻：切片温度-18°—-20° 冰冻：切片温度-18°—-20° 直接贴切好于冰冻丙酮中固定5分后分后-20° 切好于冰冻丙酮中固定分后 ° 保存。保存。
组化实验设计
1.对常规组织切片进行仔细观察根据可提供对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供对常规组织切片进行仔细观察形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标形态学特点选择最佳并能反映病变的组织标本 2.列出免疫组化的指标列出免疫组化的指标 3.进行预实验设立阳性、阴性对照进行预实验(设立阳性进行预实验设立阳性、阴性对照) 4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育找出抗体的最佳修复方法、找出抗体的最佳修复方法稀释度、温度及孵育时间 5.每张切片应表明抗体名称防止相互混淆每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆每张切片应表明抗体名称
• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水阻断液： 2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配） • 修复液：（修复液：（：（400ml））柠檬酸0.16g 柠檬酸钠柠檬酸钠1.18g 柠檬酸 • 苏木素：苏木素： • 100g硫酸铝钾加热溶于硫酸铝钾加热溶于1250ml水中硫酸铝钾加热溶于水中 • 5g苏木素精粉末溶于苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中苏木素精粉末溶于无水乙醇中 • 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸溶解后硫酸铝钾稍凉， 20-30分，加入氧化汞煮沸分钟，氧化汞煮沸2分钟分加入g氧化汞煮沸分钟，
实验过程
—70°考片一夜 ° —二甲苯个每个分钟无水乙醇，95%，90%，二甲苯3个每个分钟无水乙醇，二甲苯个每个10分钟无水乙醇，， 85%，80%每个分钟每个10分钟，每个 —3%双氧水阻断室温分钟（现配现用）双氧水阻断室温10分钟双氧水阻断室温分钟（现配现用） —抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒）抗体修复液（一次一个抗体盒）抗体修复液现配，一次一个抗体盒微波炉高火6-7分微波炉高火分 —冷却至室温冷却至室温 —再修复一次冷却再修复一次冷却 —PBS5分×3 分 —擦片加一抗，4°过夜擦片加一抗， ° 擦片加一抗