六章沉淀反应
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1h。
对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
负极泳动
2020/11/18
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。
• 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合 。
• 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
2020/11/18
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
2020/11/18
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～
单克隆抗体；多克隆抗体； 可出现假性降低与增高
• 双环现象
不同扩散率抗原性相同的两个 组分
2020/11/18
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病 理血清
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原（IgM）
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
2020/11/18
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
2020/11/18
二、火箭免疫电泳
原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计
2.抗原或抗体相对分子 量的估计
环的大小与抗原的浓度成正 相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
2020/11/18
二、免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例 合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定 大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度 。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而 检测抗原含量。
2020/11/18
2020/11/18
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
2020/11/18
第四节 免疫电泳技术
2020/11/18
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
t1为 16～ 24h；t2为24～48h；t3为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
影响因素：
• 抗体质量 • 标准曲线 ，质控血清 • 结果与真实含量不符
第三节 凝胶内沉淀试验
2020/11/18
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓 度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的 位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯 酰胺凝胶。
2020/11/18
一、单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。
第六章 沉淀反应
2020/11/18
第六章 Biblioteka Baidu淀反应
第一节 沉淀反应的特点 第二节 液体内沉淀试验
一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定
2020/11/18
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
2020/11/18
一、 絮状沉淀试验
•絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
2020/11/18
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
抗体稀释法：抗体最适比例
免疫浊度测定
影响因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
2020/11/18
免疫浊度测定
分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
2020/11/18
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
2020/11/18
沉淀反应可分三类
液体内沉淀 试验
免疫 浊度 测定 絮状 沉淀 试验
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凝胶内沉淀 试验
单向 扩散 试验 双向 扩散 试验
凝胶免疫电 泳技术
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
第二节 液体内沉淀试验
对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
负极泳动
2020/11/18
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。
• 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合 。
• 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
2020/11/18
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
2020/11/18
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～
单克隆抗体；多克隆抗体； 可出现假性降低与增高
• 双环现象
不同扩散率抗原性相同的两个 组分
2020/11/18
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病 理血清
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原（IgM）
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
2020/11/18
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
2020/11/18
二、火箭免疫电泳
原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计
2.抗原或抗体相对分子 量的估计
环的大小与抗原的浓度成正 相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
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二、免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例 合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定 大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度 。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而 检测抗原含量。
2020/11/18
2020/11/18
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
2020/11/18
第四节 免疫电泳技术
2020/11/18
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
t1为 16～ 24h；t2为24～48h；t3为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
影响因素：
• 抗体质量 • 标准曲线 ，质控血清 • 结果与真实含量不符
第三节 凝胶内沉淀试验
2020/11/18
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓 度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的 位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯 酰胺凝胶。
2020/11/18
一、单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。
第六章 沉淀反应
2020/11/18
第六章 Biblioteka Baidu淀反应
第一节 沉淀反应的特点 第二节 液体内沉淀试验
一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定
2020/11/18
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
2020/11/18
一、 絮状沉淀试验
•絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
2020/11/18
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
抗体稀释法：抗体最适比例
免疫浊度测定
影响因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
2020/11/18
免疫浊度测定
分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
2020/11/18
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
2020/11/18
沉淀反应可分三类
液体内沉淀 试验
免疫 浊度 测定 絮状 沉淀 试验
2020/11/18
凝胶内沉淀 试验
单向 扩散 试验 双向 扩散 试验
凝胶免疫电 泳技术
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
第二节 液体内沉淀试验