胚胎冷冻保存
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上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤
⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液 形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部 的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 ⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶 质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的 一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 ⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢 出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚 胎造成致命的机械损伤。
方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中2～5分钟平衡后，即 投入液氮。
胚胎玻璃化冷冻
（2）Zhu等玻璃化冷冻保存法：
主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；
玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS； 方法：室温下，将胚胎在10％乙二醇或10％甘油或10％乙 二醇＋10％二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS 或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。 此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆 可进行冷冻保存。
内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏 性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。
常规冷冻法
（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室 温或37℃水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎 有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会 伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液， 进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入 低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等 渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培 养。
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻 璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透
过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化
学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻 剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
胚胎冷冻保存方法
⑴ 常规冷冻法： “植冰”后控制降温速度，避免过
快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎 过分脱水而产生溶质效应。
⑵ 超速冷冻法： 非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱
水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。
⑶ 玻璃化冷冻法： 应用高浓度防冻剂，使胚胎内外
液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近， 控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚 胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成 玻璃体，直接投入液氮保存。
常规冷冻程序
• • • • • •
从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中: 装入细管 (编号预先准备好)
1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 放入冷冻容器 -6.0℃
Seeding ice 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 放入液氮容器
胚胎玻璃化冷冻
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚胎解冻
解冻方法：
• 慢速解冻：以4-25℃/min的速率使胚胎由冷冻保 存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当 温度由-196 ℃升到-50～-15 ℃埋，细胞内仍可能 形成大冰晶而致死胚胎。
• 快速解冻：温水浴法，以300-360 ℃/min的速率 使胚胎在30-40s内从-196 ℃至室温。
胚胎解冻
脱除保护剂：
目的：防止保护剂对胚胎的毒性；
防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗 透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨 胀受损。 • 经典方法：浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐 费时，但有效； • 蔗糖等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；
胚 胎 冷 冻 保 存
胚胎冷冻保存的基本概念
将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存
的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新
技术，是胚胎移植技术的重大突破。
胚胎冷冻保存的意义
• 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚 胎移植技术的效率；
• 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；
• 便于国际间交流；
常规冷冻法
（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓
慢降温。
• 以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮； • 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； • 以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分
充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞
胚胎细管编号 胚 胎细管编号
胚胎公司冷冻编号 配种编号 供体母牛登记 公牛登记 Betsy
直接移植胚 胎号
E546 - SM 4567891
DT 1 %
M1
2223333
98 Mar, 27
冷wenku.baidu.com日期 胚胎发育阶段 胚胎质量
胚胎装管
冷冻保存的要点
保护细胞膜免受损害； 保护胚胎细胞，免受晶体损害； 具有“渗透活性”； 解冻后保护剂必须从细胞内去掉； 甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢 慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉； 乙二醇 ：直接胚胎移植方法, 通过细胞膜快速扩散， 因而不需要慢慢去掉。
特点：分子量大，不进入细胞
基础液： mPBS （改良）、 TCM-199 、 PBS 、
HEPES等，最常用mPBS。
抗冻剂的种类及作用
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平 衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中 冷冻保存。
胚胎玻璃化冷冻
（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护 剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性 强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利 于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎 细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶 液；
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功；
1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有
1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经
10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～
100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)， 两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透 过性抗冻剂。
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上 端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制 性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以 防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致 使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内 封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法 诱发结冰。
• 替代种畜引种。
抗冻剂的种类及作用
⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（ EG ）、丙二醇（ PG ）和 DMSO
等，防止溶质效应。 特点：分子量小于100，易于渗透
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等， 降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使 胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形 成。
胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤
⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液 形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部 的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 ⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶 质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的 一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 ⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢 出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚 胎造成致命的机械损伤。
方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中2～5分钟平衡后，即 投入液氮。
胚胎玻璃化冷冻
（2）Zhu等玻璃化冷冻保存法：
主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；
玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS； 方法：室温下，将胚胎在10％乙二醇或10％甘油或10％乙 二醇＋10％二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS 或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。 此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆 可进行冷冻保存。
内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏 性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。
常规冷冻法
（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室 温或37℃水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎 有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会 伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液， 进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入 低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等 渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培 养。
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻 璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透
过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化
学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻 剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
胚胎冷冻保存方法
⑴ 常规冷冻法： “植冰”后控制降温速度，避免过
快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎 过分脱水而产生溶质效应。
⑵ 超速冷冻法： 非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱
水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。
⑶ 玻璃化冷冻法： 应用高浓度防冻剂，使胚胎内外
液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近， 控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚 胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成 玻璃体，直接投入液氮保存。
常规冷冻程序
• • • • • •
从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中: 装入细管 (编号预先准备好)
1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 放入冷冻容器 -6.0℃
Seeding ice 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 放入液氮容器
胚胎玻璃化冷冻
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚胎解冻
解冻方法：
• 慢速解冻：以4-25℃/min的速率使胚胎由冷冻保 存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当 温度由-196 ℃升到-50～-15 ℃埋，细胞内仍可能 形成大冰晶而致死胚胎。
• 快速解冻：温水浴法，以300-360 ℃/min的速率 使胚胎在30-40s内从-196 ℃至室温。
胚胎解冻
脱除保护剂：
目的：防止保护剂对胚胎的毒性；
防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗 透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨 胀受损。 • 经典方法：浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐 费时，但有效； • 蔗糖等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；
胚 胎 冷 冻 保 存
胚胎冷冻保存的基本概念
将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存
的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新
技术，是胚胎移植技术的重大突破。
胚胎冷冻保存的意义
• 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚 胎移植技术的效率；
• 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；
• 便于国际间交流；
常规冷冻法
（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓
慢降温。
• 以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮； • 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； • 以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分
充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞
胚胎细管编号 胚 胎细管编号
胚胎公司冷冻编号 配种编号 供体母牛登记 公牛登记 Betsy
直接移植胚 胎号
E546 - SM 4567891
DT 1 %
M1
2223333
98 Mar, 27
冷wenku.baidu.com日期 胚胎发育阶段 胚胎质量
胚胎装管
冷冻保存的要点
保护细胞膜免受损害； 保护胚胎细胞，免受晶体损害； 具有“渗透活性”； 解冻后保护剂必须从细胞内去掉； 甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢 慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉； 乙二醇 ：直接胚胎移植方法, 通过细胞膜快速扩散， 因而不需要慢慢去掉。
特点：分子量大，不进入细胞
基础液： mPBS （改良）、 TCM-199 、 PBS 、
HEPES等，最常用mPBS。
抗冻剂的种类及作用
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平 衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中 冷冻保存。
胚胎玻璃化冷冻
（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护 剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性 强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利 于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎 细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶 液；
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功；
1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有
1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经
10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～
100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)， 两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透 过性抗冻剂。
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上 端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制 性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以 防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致 使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内 封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法 诱发结冰。
• 替代种畜引种。
抗冻剂的种类及作用
⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（ EG ）、丙二醇（ PG ）和 DMSO
等，防止溶质效应。 特点：分子量小于100，易于渗透
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等， 降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使 胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形 成。