真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

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真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。

但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及;③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。

原核&真核表达载体构建

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建真核表达载体和原核表达载体的区别:主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。

比如说启动子,终止子在两种表达系统中是不一样的。

带有真核表达元件的是真核载体,能在真核生物内表达;带有原核表达元件的是原核载体,能在原核生物内表达。

两者都具有的为穿梭载体。

㈠原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。

原核表达载体调控原件1.启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。

没有启动子,基因就不能转录。

由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。

原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。

在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。

来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。

在距转录起始位点上游35 bp 处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。

转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。

-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA 链。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。

2. SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。

昆虫表达系统

昆虫表达系统

昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳 核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核 型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主 要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚 期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种 表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵 宿主细胞的方式都不相同。 由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表 达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表 达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣 一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的 基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有 些仅仅只具有结构蛋白的作用。 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病 毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于 晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了 这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。

真核载体构建

真核载体构建

42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克 得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min (合适抗生素) (使质粒扩增)
37℃ 10hr
2.感染(infection):也称转导(transduction) 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 有一个:体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR,Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双 酶 切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1:10~ 10:1(1:3 ~ 3:1)摩尔比 v At 25 °C for 2­3 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点:①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染(内毒素) ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制

真核表达载体

真核表达载体

真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

基因工程中常用载体及其主要特点

基因工程中常用载体及其主要特点

基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题,听起来就像科幻小说里的情节,其实离我们并不遥远。

今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体,简单明了,让你听得懂,明白得了!准备好了吗?那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧!1. 什么是载体?首先,得先搞清楚,什么是载体。

简单来说,载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。

它们把我们想要的基因装上,然后送到目标细胞里。

这就像是你点了一份外卖,外卖小哥把美味的食物送到你家。

没有它们,我们的基因工程可就没法开展了。

想象一下,如果没有这些小哥,基因可怎么进得了细胞的大门呢?1.1 质粒载体说到载体,质粒可算是老前辈了。

质粒就像是细菌的“USB闪存”,它能自我复制,携带外来基因,简直就是基因工程的明星。

质粒的特点是操作简单、成本低,而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。

想想看,若是你把一张重要的文件放在闪存里,不仅可以在一台电脑上使用,还能借给朋友,这种“共享经济”在基因界也在不断上演。

质粒载体就是这样的存在,方便又实用,真是个好帮手!1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。

这个名字听起来就有点威风,实际上它就是一种能感染细菌的病毒。

噬菌体载体像个特种部队,能精准地将目标基因送到细菌里。

它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。

想象一下,像忍者一样悄无声息地完成任务,真是酷毙了!当然,它的使用相对复杂,需要一定的技术支持,不过一旦掌握,可是非常厉害的工具。

2. 常见的真核载体讲完细菌的载体,咱们再来看真核细胞的载体,这可得好好聊聊了。

2.1 真核表达载体真核表达载体,是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。

这就像是在高档餐厅里,得有专业的厨师才能把菜做好。

真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。

它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。

举个例子,就像你去商场买了新衣服,得先试穿才知道合不合适,对吧?这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适,才能发挥作用。

载体选择

载体选择

1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

真核生物表达系统汇总

真核生物表达系统汇总

2020年8月10日星期一
16
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B


牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
2020年8月10日星期一
17
(3)选择标记
18
b、ADA基因:ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶,Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因:
d、HPH基因:该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达:转染的DNA未与宿主 染色体整合,不能随宿主基因组的复 制而扩增,只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达:转染的DNA与宿主染 色体整合,能随宿主基因组的复制转 录和翻译,并被稳定遗传。
2020年8月10日星期一
7
五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因:新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶,使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶, 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时,真核 细胞表达系统是首要的选择,尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等,这些蛋白质

蛋白表达系统分类-概述说明以及解释

蛋白表达系统分类-概述说明以及解释

蛋白表达系统分类-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白表达系统是一种重要的生物技术工具,被广泛应用于抗原制备、药物研发、基因工程、蛋白质学等领域。

它通过利用生物体内特定的遗传信息和代谢途径,将外源基因转化为蛋白质产物。

蛋白表达系统的分类主要根据基因表达介体的类型,可以分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统。

真核细胞表达系统主要利用哺乳动物细胞或昆虫细胞等真核细胞作为基因表达的宿主,能够产生复杂的蛋白质结构和正确的糖基化修饰。

而原核细胞表达系统则采用细菌或酵母等原核细胞作为基因表达的宿主,具有表达速度快、成本低等优势。

不同类型的蛋白表达系统具有各自的特点和适用领域。

真核细胞表达系统适用于需要复杂蛋白质结构和糖基化修饰的研究和应用,比如抗体制备和疫苗研发。

原核细胞表达系统则更多应用于产生大量重组蛋白质的需求,比如重组酶的制备和蛋白质互作研究。

随着生物技术的不断发展,蛋白表达系统也在不断创新和完善。

例如,通过引入特定的转化子和表达载体,蛋白表达系统的产量和纯度得到了显著提高。

同时,基因工程技术的进步也为蛋白表达系统的开发提供了更多的机会和可能性。

未来,随着对蛋白质功能和结构的深入研究,蛋白表达系统将在生物医学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。

综上所述,蛋白表达系统是一种关键的生物技术工具,通过利用生物体内的遗传信息和代谢途径,转化外源基因为蛋白质产物。

其根据基因表达介体的类型可分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统,各具特点和适用领域。

随着科学技术的进步,蛋白表达系统的发展前景是十分广阔的。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以描述文章的组织和布局,以及每个章节的内容概述。

以下是一个可能的写作示例:在本文中,将对蛋白表达系统进行分类,并深入探讨每个分类的特点、应用领域和发展历程。

本文主要分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分首先对蛋白表达系统进行概述,介绍其在生物医学领域的重要性和应用价值。

真核细胞表达系统

真核细胞表达系统

真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒/昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。

简而言之,酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高,生产成本低,但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其表达量低、操作烦琐。

1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母,后来相继出现其他种类酵母,其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。

甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志,可在大肠杆菌大量扩增。

甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列,容易整合入酵母染色体中。

大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1),在强启动子作用下,以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。

甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平,实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。

2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达,其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。

杆状病毒系统蛋白表达量很高,而且大部分蛋白质能保持可溶性。

杆状病毒基因组较大(130kb),可容纳大的外源DNA片段;杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性,安全性较高。

目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体,能快速有效地产生重组杆状病毒。

与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比,大大简化了操作步骤,缩短了鉴定重组病毒的时间,适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。

3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠,它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰,在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质,几乎都能在细胞内准确定位,在医学研究中得到广泛应用。

虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大,更耗时,成本更高,但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

真核表达系统与原核表达系统比较

真核表达系统与原核表达系统比较

系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说,哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。
针对其各自的优缺点,如下:
真核系统和原核系统各自优缺点:
表达系统
系统优缺点
系统蛋白表达方式 优点
缺点
表达的蛋白活性高, 瞬时转染
能够快速灵活的制 蛋白表达量低,大
能够表达多复杂修饰
备活性蛋白
量生产成本极高
哺乳动
的蛋白;
稳定细胞系构建 筛选出的细胞株能 细胞株筛选困难且
真 核 表 达 物细胞
需要细胞房,无菌,
够实验蛋白的大量 时间长,投入大
系统
成本投入高
生产
重组抗体表达
比普通单抗生产量 需筛选细胞株,需
有保证
耗时耗力
酵母表
与哺乳动物相比只能 毕赤酵母表达
甲醇诱导操作方面 需要时间
达系统
表达简单修饰的蛋白 酿酒酵母表达
更多蛋白表达系统比较,原理与常见问题解决和标准试验操作资料,请见: /topics/dan-bai-biao-da.html 我们会不断更新补充,欢迎收藏!
Tel: (025) 5889- 4959

Order@
不常用Biblioteka 不常用昆虫表不常用
达系统
原 核 蛋 白 大 肠 杆 菌 操作简单。表达量高;
表达系统 表达
易形成包涵体,蛋白活性物保证
Tel: (025) 5889- 4959

Order@
枯 草 芽 孢 不常用
杆菌表达
链霉菌
不常用
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions

分子生物学:真核生物表达系统

分子生物学:真核生物表达系统

人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因 劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因 猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β-珠蛋白基因
40~160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
2013年7月27日星期六
17
(2)多聚腺苷酸化信号(加尾信号):所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结 构,多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化 位点上游11~30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成,
2013年7月27日星期六
22
(4)复制子:哺乳动物基因表达载体的 复制子一般采用病毒基因组的复制子, 由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞 内进行自主复制。不同的病毒复制子的 工作效率不同,常用于构建哺乳动物表 达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛 乳头瘤病毒等的复制子。
2013年7月27日星期六
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
2013年7月27日星期六 3
一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较 大肠杆菌 产率 蛋白酶消化
2013年7月27日星期六 26
2013年7月27日星期六
27
pCMV-HA:为Clontech公司产品, 该质粒载体含CMV启动子,在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内 含子,在N端有血凝素(HA)表位标签 和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
2013年7月27日星期六 6
病毒感染 转染
化学法
物理法

常见的真核和原核表达系统的启动子(promoters)

常见的真核和原核表达系统的启动子(promoters)
SV40
常规表达用
mRNA
猿猴空泡病毒40来源的哺乳动物表达启动子
组成型
可能包含一个增强子
PGK1 (人/小鼠)
常规表达用
mRNA
磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子
组成型
广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用,倾向于抵抗启动子下调。
Ubc
常规表达用
mRNA
人类泛素C基因来源的哺乳动物启动子
CaMV35S
常规表达用
mRNA
花椰菜花叶病毒的强植物启动子
组成型
在双子叶植物激活,在单子叶植物中稍微弱一些,在一些动物细胞中有活性。
Ubi
常规表达用
mRNA
玉米泛素基因的植物启动子
组成型
在植物中促进高表达
H1
小RNA表达
shRNA
来源于人聚合酶III RNA启动子
组成型
可能比U6启动子弱一点,在神经元细胞中表现更佳
U6
小RNA表达
shRNA
来源于人U6小核启动子
组成型
小鼠U6也使用,但效率略差。
常用的原核表达系统启动子
启动子
主要用途
描述
表达
备注
T7
体外转录/常规表达
T7噬菌体来源的启动子
组成型,需要T7 RNA聚合酶
当用于体外转录的时候,外转方向有可能是正向的也可能是反向的,取决于启动子相对于目的基因的方向
T7lac
araBAD
常规表达用
阿拉伯糖代谢操纵子的启动子
阿拉伯糖诱导
弱,常用与pBAD载体。适合于快速调控和低的本底表达
trp
高水平基因表达
色氨酸操纵子来源的启动子

蛋白表达形式

蛋白表达形式

蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种:
1. 原核表达系统:原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一,主要利用大肠杆菌(E.coli)作为宿主细胞。

该系统具有操作简单、表达量高等优点,适用于小分子量蛋白的表达。

在原核表达系统中,常用的表达载体包括质粒和噬菌体。

质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中,然后将质粒导入宿主细胞,利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。

噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞,将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中,然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。

原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

2. 真核表达系统:真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞,可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。

除此之外,还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式,并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

真核表达系统

真核表达系统

真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利,eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN),降低了本钱,扩大了来源,也缩短了生产周期。

可是由于原核细胞中没有转录后加工系统,不能识别、剪除内含子,因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达;另外,原核细胞缺乏翻译后加工系统,不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。

因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后,尽管一样形成蛋白质具有抗原性,却因为不能糖基化,而不产生功能。

例如,C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基),因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径,是一种极好的补体抑制剂,若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE),表现为全身水肿,尤其是喉头水肿,能够输血,以正常人血中的C1INH来补充医治,但长期输血价钱高,易引发副反映,故可用基因工程产品来医治HANE,但因C1INH为高度糖基化蛋白,在中表达没有活性,现已有人利用CHO表达C1INH,拟用于医治。

一、优势1.具转录后加工系统;2.具翻译后修饰系统;3.可实现真正的分泌表达,分泌至细胞外简化了纯化工艺。

二、真核基因结构及表达调控特点:(一)、基因结构特点:1.DNA极为丰硕,具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA,反转录合成为cDNA。

尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同,但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题,基因在不同细胞中转录情形不一样,产生不同的功能蛋白,才表现出各类细胞的丰硕多样性。

故应选择mRNA丰度高的细胞为材料,eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。

2.结构复杂,DNA与组蛋白结合,并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。

3.不持续性:内含子、外显子。

内含子可能参与基因调控,不同剪切方式产生不同蛋白质。

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真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。

但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及;③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。

因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。

目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

1.酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。

目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。

以Pichia Pastoris应用最多。

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。

大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1),在该基因的启动子(PAXOI)作用下,外源基因得以表达。

PAXOI是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。

甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。

此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体,其中含有E.coli复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前,将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。

甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。

培养至高浓度。

再以甲醇为碳源。

诱导表达外源蛋白。

这样可以大大提高表达产量。

利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。

与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。

利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平,而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。

使得实验操作过程中存在不小的危害性。

且不宜于食品等蛋白生产。

因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。

利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI,不需要甲醇诱导。

培养过程中无需更换碳源,操作更为简便,可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。

2.昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统,该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。

在AcNPV感染昆虫细胞的后期,核多角体基因可编码产生多角体蛋白,该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。

核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力,故常被用来构建杆状病毒传递质粒。

克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组,重组后多角体基因被破坏,因而在感染细胞中不能形成包涵体,利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低,且载体构建时间长,一般需要4~6周。

此外,昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。

在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化工作变得很困难,另外水解酶的释放会降解重组蛋白。

为了克服以上这些困难,科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白,但效果都不明显。

Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统,该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列:(1)Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子;(2)Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白,该蛋白是种转录激活因子,可在体外激活肌动蛋白基因启动子);(3) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。

三者协同作用,可使转录活性提高1000倍以上,从而大大地提高外源蛋白的表达水平。

另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建,该病毒由AcNPV及Bni'qP发展而来。

一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的,大部分为非分泌性。

为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平,这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。

如果到达内质网前,前体多肽就伸展开来,暴露出疏水残基,残基间的相互作用可引起多肽的凝聚,这对最终的表达水平有很大影响。

而Hsp70是一种分子伴侣,能够与新翻译的多肽结合,抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工,从而提高蛋白的分泌水平。

最近,人们又构建了杆状病毒-S2表达系统,该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞,以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如sf9、sf21)中复制,不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制,然而目前研究表明在一定条件下,杆状病毒也能感染果蝇细胞。

在果蝇细胞中,杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。

杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等,其中,Hsp70启动子的作用最强。

重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似,因此,杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。

昆虫细胞表达系统,特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全,表达量高,目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

3.哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统,更接近于天然蛋白质。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法:一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。

外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体,如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统,而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。

目前,病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具,在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。

痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb),利用它作为载体可同时插入几种外源基因,从而构建多价疫苗。

另外,逆转录病毒感染效率高,某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因,但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体,具有潜在的危险性。

由于腺病毒易于培养、纯化,宿主范围广,故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。

但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低,利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高,即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒,将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。

另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体,在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点,然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞,通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组,可获得重组腺病毒,这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。

最近,人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。

由于杆状病毒是昆虫病毒,在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达,而且载体的构建容易,因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。

利用哺乳动物细胞表达外源基因时,大多数情况下不需要诱导,但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导,这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。

哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导,还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。

但这些系统存在一些共同的缺陷,如诱导表达特异性差;当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性,常对细胞造成损伤等。

为此,Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统,该系统由调节质粒和反应质粒组成。

调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列,在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。

随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造,构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统,该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活,而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。

四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效可控制性强的优点。

外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响,因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时,一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。

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