生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(6)按每份200ul分装细胞，若不马上进行转化，该感受 态 细 胞 可 以 加 入 终 浓 度 为 10 ％ 的 灭 菌 甘 油 ， 置 于 70℃冻贮。
转化( transformation)： a．用新鲜制备的（或从-80℃冰箱中取出置冰上5
分钟至刚好解冻的）感受态细菌100μl感受态 细菌至预冷管中。 b．加入1-50ng DNA，用微量移液器吸头搅动两次， 以便DNA扩散均匀，用手指弹动管壁数次。 c．马上放置冰上30分钟。
宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一 个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。
在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有 两个概念： ➢转化(transformation or introduction)：特 指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细 菌的过程。 ➢转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以 它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）: 操作步骤 ( protocol)：
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944） 2.DNA结构双螺旋模型 (Watson & Crick, 1953) 3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg
(3)将培养物于冰上放置10分钟，然后转移到两个50ml 离心管中，4000rpm/min，4℃离心10分钟。
(4)弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，然后加 人10ml用冰预冷的0.1mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置 于冰上10分钟。
(5)4000rpm/min，4℃离心10分钟回收细胞，弃上清，每 50ml的原培养物再加入2ml冰冷的0.1mmol/L CaCl2溶 液，悬浮细胞。
DNA
克 隆 外 源 基 本 流 程 图 示
2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 （1）分离制备待克隆的DNA片段； （2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接； （3）重组DNA分子转入宿主细胞； （4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；
2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 （1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然 后分离所需要的DNA片段（原核基因）； （2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反 转录合成cDNA（真核基因）； （3）用化学法人工合成DNA。
2.2 靶DNA片段与载体的连接 2.2.1 载体的选择与改造应具备下几个条 件： (1)载体上应具备完成实验目的的最基本元 件：如载体上应具有适当的启动子、终止 子等。
(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的 DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位 点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取 代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制 和增殖。
Paul Berg
Herb Boyer
1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced theLeabharlann Baidufirst recombinant
DNA molecules.
They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA",
1973年是基因工程的元年。 这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家 的心血与努力，他们在理论与技术上的卓 越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的 基础。
一、基因克隆的策略与技术路线 1.基因克隆的策略
克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细 胞组成的群体的过程。
在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基 因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子 与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主 复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前 基因克隆的主要策略。
(1)将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16— 20小时。
(2) 从 平 板 中 取 出 1 个 2-3mm 大 小 的 单 菌 落 ， 移 至 含 100ml LB 培 养 基 的 500ml 三 角 瓶 中 ， 37℃ 280rpm/min强烈振荡培养3小时，使细胞的浓度达到 对数生长期或对数生长前期，细菌的OD.600一般在 0.2—0.4之间。
(3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作， 同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。
(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和 阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基 因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。
(5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的 启动子、信号肽序列、 SD顺序、加尾信号、增 强子等调控元件。
& Crick ） 4.发现反转录酶(Baltimore & Temin, 1970) 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究
(Lederberg, 1950-1970) 6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，
Smith和Nathans） 7. DNA体外重组（ Cohen等，1973）
2.2.2 DNA的连接
限制性内切酶处理DNA后，一般产生粘性末端、 平末端两种形式。 两个DNA片段有以下几种出现方式： ①两个不同的粘性末端； ②两个相同的粘性末端； ③一个粘性末端一个平末端； ④两个平末端。 注意：提高连接效率、降低假阳性！
2.3 重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞
受体细胞也称宿主，是重组子扩增及表达的场 所，分为原核细胞和真核细胞两类。 ➢ 原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌 等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所， 也可以作为外源基因的表达系统）。 ➢ 真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞 等。
转化( transformation)： a．用新鲜制备的（或从-80℃冰箱中取出置冰上5
分钟至刚好解冻的）感受态细菌100μl感受态 细菌至预冷管中。 b．加入1-50ng DNA，用微量移液器吸头搅动两次， 以便DNA扩散均匀，用手指弹动管壁数次。 c．马上放置冰上30分钟。
宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一 个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。
在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有 两个概念： ➢转化(transformation or introduction)：特 指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细 菌的过程。 ➢转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以 它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）: 操作步骤 ( protocol)：
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944） 2.DNA结构双螺旋模型 (Watson & Crick, 1953) 3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg
(3)将培养物于冰上放置10分钟，然后转移到两个50ml 离心管中，4000rpm/min，4℃离心10分钟。
(4)弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，然后加 人10ml用冰预冷的0.1mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置 于冰上10分钟。
(5)4000rpm/min，4℃离心10分钟回收细胞，弃上清，每 50ml的原培养物再加入2ml冰冷的0.1mmol/L CaCl2溶 液，悬浮细胞。
DNA
克 隆 外 源 基 本 流 程 图 示
2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 （1）分离制备待克隆的DNA片段； （2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接； （3）重组DNA分子转入宿主细胞； （4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；
2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 （1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然 后分离所需要的DNA片段（原核基因）； （2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反 转录合成cDNA（真核基因）； （3）用化学法人工合成DNA。
2.2 靶DNA片段与载体的连接 2.2.1 载体的选择与改造应具备下几个条 件： (1)载体上应具备完成实验目的的最基本元 件：如载体上应具有适当的启动子、终止 子等。
(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的 DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位 点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取 代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制 和增殖。
Paul Berg
Herb Boyer
1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced theLeabharlann Baidufirst recombinant
DNA molecules.
They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA",
1973年是基因工程的元年。 这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家 的心血与努力，他们在理论与技术上的卓 越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的 基础。
一、基因克隆的策略与技术路线 1.基因克隆的策略
克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细 胞组成的群体的过程。
在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基 因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子 与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主 复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前 基因克隆的主要策略。
(1)将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16— 20小时。
(2) 从 平 板 中 取 出 1 个 2-3mm 大 小 的 单 菌 落 ， 移 至 含 100ml LB 培 养 基 的 500ml 三 角 瓶 中 ， 37℃ 280rpm/min强烈振荡培养3小时，使细胞的浓度达到 对数生长期或对数生长前期，细菌的OD.600一般在 0.2—0.4之间。
(3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作， 同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。
(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和 阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基 因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。
(5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的 启动子、信号肽序列、 SD顺序、加尾信号、增 强子等调控元件。
& Crick ） 4.发现反转录酶(Baltimore & Temin, 1970) 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究
(Lederberg, 1950-1970) 6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，
Smith和Nathans） 7. DNA体外重组（ Cohen等，1973）
2.2.2 DNA的连接
限制性内切酶处理DNA后，一般产生粘性末端、 平末端两种形式。 两个DNA片段有以下几种出现方式： ①两个不同的粘性末端； ②两个相同的粘性末端； ③一个粘性末端一个平末端； ④两个平末端。 注意：提高连接效率、降低假阳性！
2.3 重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞
受体细胞也称宿主，是重组子扩增及表达的场 所，分为原核细胞和真核细胞两类。 ➢ 原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌 等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所， 也可以作为外源基因的表达系统）。 ➢ 真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞 等。