神经细胞培养讲义
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
10
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
ppt课件
1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
神经细胞培养
传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
原代神经元培养培训课件
精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
【最全PPT】神经细胞体外培养方法及应用
舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液
370C，30min
舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液
用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次
若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打
将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向 沉淀加培养液，离心1200r/min，8min
破伤风毒素
所需培养液量少，可反应组织代谢中
膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。
（优选）神经细胞体外培养方法及应用
NSE 组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养
组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养 神经体外培养的生长基质
终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化
保留了植块内组织特征
不足
培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难
以观察单个神经元生长。
神经元的分离细胞培养方法
1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，
剪碎，3,用D-Hank’s充分洗去残血
2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 25%胰蛋白酶和5滴0.
N1的配方为
胰岛素5μg/ml 转铁蛋白5μg/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM
神经体外培养的生长基质
胶元 多聚赖氨酸 LN
神经细胞培养操作程序表
脊髓后根节 孕18~20天大鼠胚胎
神经生物学实验课细胞培养
7. 加含10%FBS的DMEM10ml，吸管轻匀吹打， 尽量使组织分散。
8. 离心1500rpn，5分钟。 9. 弃上清，加10mlDMEM10%FBS，吸管轻匀吹
打，200目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。 10. 以105的接种于培养瓶中，标记后置37℃，含
5%CO2培养箱培养。 11. 12-24小时后，换液观察。
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶 原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白 先吸附于底物上，悬浮细胞再与底物附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基 团）
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细 胞株潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活 力最佳，最适合进行实验研生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液
后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2
一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3 贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
贴壁生长细胞传代方法
1. 吸光培养瓶中的培养液。 2. 用无钙镁离子的PBS清洗细胞3遍. 3 . 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个
瓶底为准），静置1-2 min（显微镜下动态监测）。 4. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 5. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细
胞悬液。 6. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 7. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 8. 将后者放入培养箱中培养。
神经细胞培养讲义
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
缺点：1）仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染：为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，
• 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解
乳蛋白） 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
原始数据图，颜色表示荧光强度
Neuroblastoma cells on silicon wafer
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数）
b 悬浮生长型细胞（少数）
2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
(高三生物核心素养教案)第八单元 第24讲 通过神经系统的调节
第24讲通过神经系统的调节一、考纲要求：1.人体神经调节的结构基础和调节过程(Ⅱ)。
2.神经冲动的产生、传导和传递(Ⅱ)。
3.人脑的高级功能(I)。
二、教学目标：1.能说出神经元的结构和功能，反射与反射弧功能。
2.理解神经冲动的产生、传到和传递过程。
3.概述神经系统的分级调节和人脑的高级功能素养培养目标：1．生命观念：通过分析反射弧各部分结构的破坏对功能的影响，建立结构与功能相统一的观点。
2．科学思维：通过判断反射弧中的传入神经和传出神经及分析膜电位的变化曲线，培养科学思维的习惯。
3．科学探究：通过实验“膜电位的测量”及“反射弧中兴奋传导特点的实验探究”，提升实验设计及对实验结果分析的能力。
三、教学重、难点：1.教学重点：人体神经调节的结构基础和调解过程2.教学难点：神经冲动的产生、传导和传递四、课时安排：3课时五、教学过程：考点一反射和反射弧（一）知识梳理：（学生自主看书填空、课堂学生间交流反馈纠正）1．神经元的结构与功能(1)填出下图中所示结构名称(2)比较树突和轴突2.反射与反射弧3．反射弧中相关结构对反射弧功能的影响（二）基础训练（课前完成，课上提问）：讲义P185（三）拓展（教师精讲）如图是反射弧的结构模式图。
a、b分别是放置在传出神经和骨骼肌上的电极，用于刺激神经和骨骼肌；c 是放置在传出神经上的电位计，用于记录神经兴奋电位；d为神经与肌细胞接头部位，是一种突触。
(1)用a刺激神经，产生的兴奋传到骨骼肌引起的收缩不属于(填“属于”或“不属于”)反射。
(2)用b刺激骨骼肌，不能(填“能”或“不能”)在c处记录到电位。
(3)正常时，用a刺激神经会引起骨骼肌收缩；传出部分的某一处(骨骼肌或传出神经或d)受损时，用a刺激神经，骨骼肌不再收缩。
根据本题条件，完成下列判断实验：①如果用a刺激神经，在c处不能记录电位，表明传出神经受损。
②如果用b刺激骨骼肌，骨骼肌不收缩，表明骨骼肌受损。
③如果用a刺激神经，在c处记录到电位，骨骼肌不收缩；用b刺激骨骼肌，骨骼肌收缩，表明d受损。
《神经培养技术》PPT课件
神经培养的发展历史
➢萌芽：1885年德国学者Roux将鸡胚的神经 板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内 存活数天。
➢起步：1907年，Harrison首次成功地用蛙 淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神 经细胞突起的生长过程。
➢发展：在设备、条件和方法上不断改进， 尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发 展的阶段。
原代培养（primary culture）：神经细胞一 般不再分裂，不传代，故属原代培养。 再培养（sub-culture）：把培养物切、割、 取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。 联合培养（coculture）：把两种或两种以上 的组织放在一起进行培养。
四、其它
按开创研究者的名字命名，如Maximow 双盖片法。
《神经培养技术》PPT课 件
简介
体外培养（in vitro culture）包括：
组织培养（tissue culture） 细胞培养（cell culture） 器官培养（organ culture）
就是将活体结构成分（如活体组织、细 胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出， 放在类似于体内生存环境的体外环境中，让 其生长和发育的方法。
2. 生长附加成分 比较通用的： 胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺
（丁二胺） B-27、N-2（Gibco）
全培液
以下各种成分各10 ml配制成全配 液40 ml（葡萄糖含量为6g/L）： 1. 胎牛血清 2. DMEM 3. 九天鸡胚渗出液 4. Glucose/BSS（5%葡萄糖溶液 4.7 ml， Tyrode’s BSS 5.3 ml）
低限量 Eagle培养基
DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium
细胞生物学实验讲义
植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。
2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。
二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。
它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。
植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。
组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。
三、实验用品1、材料半夏无菌苗。
2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。
3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。
4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。
5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。
母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。
(各类成分浓度、用量详见下表)。
表1 MS培养基母液配制(单位：mg)1).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。
一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。
2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。
3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。
神经细胞的培养
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细胞培养的基本条件
超净工作台的使用
使用前： 开启柜内紫外灯照射10~30min； 预工作2~3min，以除去臭氧和使工 作台面、空间呈净化状态。 使用完毕后： 要用70%酒精将台面和台内擦拭干净。
Harbin Medical University
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细胞培养的基本条件
火焰消毒
在无菌环境下培养时，首先要点燃酒精灯 ，以后的一切操作，如打开或封闭瓶口等 ，都需在火焰近处并经过烧灼。 注意事项：塑料和橡胶制品过火时要快速 ，不能长时间烧灼。
2.不能用手触及消毒器皿的工作部分， 工作台面上用品要布局合理 。 3.瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 4.吸溶液的吸管不能混用。 。
Harbin Medical University
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细胞培养的基本概念
传代培养注意事项
5.接种数量一般为5x104~8x105个 /ml。
6.传代密度太低，细胞容易死亡，表现 出细胞在达到增殖前有较长的滞留期。 7.培养液由于pH下降呈黄色，若无污 染需要换液或传代。
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Harbin Medical University
细胞培养的基本条件
细胞培养的实验用品
细胞培养瓶：25cm2，75cm2，150cm2
Harbin Medical University
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细胞培养的基本条件
细胞培养板：6孔、12孔、24孔、48孔和96 孔（包括平底、U型和V型）。
Harbin Medical University
Harbin Medical University
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三、细胞培养的基本条件
无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件
王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集大家考研用共144页
王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集课程学习：1.细胞概述>>目录1. 细胞概述1.1 细胞的发现及细胞学说的创立1.1.1 细胞的发现1.1.2 细胞学说(cell theory)的创立1.1.3 细胞学理论对细胞学发展的推动作用1.1.4 细胞生物学发展简史1.2 细胞的基本功能和特性1.2.1 细胞的基本功能1.2.2 细胞结构上的相似性1.2.3 细胞的形态1.2.4 细胞的大小及体积的恒定1.2.5 细胞及细胞器的计量单位1.3 细胞的分子基础1.3.1 水是细胞中最主要的物质1.3.2 无机盐1.3.3 小分子有机小分子1.3.4 生物分子的功能分类1.3.5 细胞结构体系的组装1.4 细胞的类型和结构体系1.4.1 原核细胞1.4.2 真核细胞的两种主要类型:动物细胞和植物细胞1.4.3 真核细胞的结构体系1.4.4 真核细胞与原核细胞的比较1.5 病毒--非细胞的生命体1.5.1 病毒是比细胞更小的生命体1.5.2 病毒的生活史1.6 细胞生命的进化1.6.1 细胞生命的起源与进化1.6.2 真核细胞的起源1.6.3 从单细胞向多细胞进化1.7 我国细胞生物学的发展战略1.7.1 细胞生物学的主要研究内容和发展方向1.7.2 我国细胞生物学发展战略学习指导课程学习：1.细胞概述>> 1.1.1 细胞的发现1. 细胞概述所有的生物都是由细胞(cell)构成的。
除了病毒、类病毒等是非细胞的生命体以外，其它生命有机体的结构和功能单位都是细胞。
细菌、酵母等微生物是以单细胞的形式存在，而高等动、植物则是由多细胞构成的，如人大约有3 ×1013个细胞，这些细胞组成不同的组织和器官。
研究细胞及其生物学功能的科学称为细胞生物学(cell biology)。
1.1 细胞的发现及细胞学说的创立第一个发现细胞的是英国学者胡克(Rorbert Hooke)，相隔170多年后，德国植物学家施来登(Mathias Schleiden)和动物学家施旺(Theodor Schwann)创立了细胞学说。
【高中生物】2.3 神经冲动的产生和传导 讲义(知识点 提升 巩固)【新教材】选择性必修一
第3节神经冲动的产生和传导知识点梳理及巩固课标内容要求核心素养对接1.阐明神经细胞膜内外在静息状态具有电位差，受到外界刺激后形成动作电位，并沿神经纤维传导。
2．阐明神经冲动在突触处的传递通常通过化学方式完成。
1.科学思维——通过分析电位产生的机理及相关曲线的解读，养成科学思维的习惯。
2．科学探究——通过反射弧中兴奋传导和传递特点的分析，提升实验设计及对实验结果分析的能力。
3．社会责任——关注滥用兴奋剂和吸食毒品的危害，能够向他人宣传这些危害，拒绝毒品。
一、兴奋在神经纤维上的传导1．神经表面电位差的实验神经表面电位差的实验示意图(1)静息时，电表没有测出电位差，说明静息时神经表面各处电位相等。
(2)而在图示位置的左侧给予刺激时，电表发生2次偏转，这说明刺激后会引起a、b间两次出现电位差。
(3)实验说明在神经系统中，兴奋是以电信号(又叫神经冲动)的形式沿着神经纤维传导的。
2．兴奋传导形式兴奋是以电信号的形式沿着神经纤维传导的，也叫神经冲动。
3．兴奋传导的机制和过程(1)静息电位表现为内负外正，是由K ＋外流形成的。
(2)动作电位表现为内正外负，是由Na ＋内流形成的。
(3)兴奋部位与未兴奋部位之间存在电位差，形成了局部电流。
(4)局部电流刺激相近的未兴奋部位发生同样的电位变化，兴奋向前传导，原兴奋部位又恢复为静息电位。
二、兴奋在神经元之间的传递1．突触小体和突触(1)突触小体：神经元的轴突末鞘经过多次分枝，最后每个小枝末端膨大，呈杯状或球状。
(2)突触：突触由突触前膜、突触间隙与突触后膜组成。
2．传递过程兴奋到达突触前膜所在的神经元的轴突末梢→突触小泡向突触前膜移动并融合释放神经递质→神经递质通过突触间隙扩散到突触后膜的受体附近→神经递质与突触后膜上的受体结合→突触后膜上的离子通道发生变化，引发电位变化→神经递质被降解或回收。
3．传递特点(1)特点：单向传递。
(2)原因⎩⎨⎧①神经递质只存在于突触前膜的突触小泡中。
2023年新教材高中生物微生物的基本培养技术讲义(无答案)新人教版选择性必修3
1.2.1 微生物的基本培养技术微生物：难以用___________观察的微小生物的统称。
包括以下类群：病毒（无细胞结构生物）：SARS 病毒、新冠病毒等____________病毒；T 2噬菌体等____________病毒。
细菌（原核生物）：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌：衣氏放线菌等。
真菌（真核生物）：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等。
防止____________，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是酵工程的重要基础。
实验室培养微生物的条件：①要为人们需要的微生物提供合适的____________和____________条件；②要确保____________无法混入，并将____________分离出来。
一、培养基的配置 1.培养基的概念和类型（1）概念：人们按照微生物对____________的不同需求，配制出供其____________的营养基质，即培养基。
（2）培养基的作用：用以____________、____________、____________、____________微生物或____________其代谢物。
（3）培养基的类型2.培养基的配制（1）基本成分：水、碳源、氮源、无机盐。
①碳源：a.无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-→____________微生物；b.有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等→____________微生物。
②氮源：a.无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等。
b.有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、____________、氨基酸等。
注意：含C、H、O、N的有机物是____________微生物的碳源、氮源、能源。
如____________等。
（2）特殊需求：某些微生物对______、特殊营养物质以及_______的需求。
特殊营养物质：____________、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。
（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加____________；②培养霉菌时，需要将培养基调至____________；③培养细菌时，需要将培养基调至____________或____________；④培养厌氧微生物时，需要提供____________的条件。
神经细胞体外培养方法及应用课件
01
神经细胞体外培养是指在体外人 工模拟体内神经细胞生长的环境 ，使神经细胞在人工条件下生长 、繁殖和维持活性的技术。
02
神经细胞体外培养是神经科学研 究的重要手段之一，通过该技术 可以研究神经细胞的生长、发育 、功能以及与疾病的关系。
神经细胞体外培养的生物学基础
神经细胞的体外培养需要模拟体内的微环境，包括适宜的温度、湿度、酸碱度、营 养物质等。
诱导多能干细胞来源的神经干细胞
03
通过诱导多能干细胞分化得到神经干细胞。
03
神经细胞体外培养的应用
神经退行性疾病的研究
帕金森病
通过体外培养神经细胞，可以模拟帕金森病的发生过程，研究其发病机制，为 治疗提供新思路。
阿尔茨海默病
利用体外培养的神经细胞，可以研究阿尔茨海默病的病理生理机制，探索药物 对神经细胞的保护作用。
神经细胞在体内存在复杂的相互作用 ，而在体外培养中，缺乏这种相互作 用可能会影响细胞的生长和分化。
营养需求
神经细胞对营养的需求较为特殊，需 要特定的生长因子、维生素和氨基酸 等，同时还需要适当的代谢底物来支 持其生经细胞时，需要遵循伦 理原则，确保研究符合法律法规和伦 理规范。
详细描述
在显微镜下观察神经细胞的形态特征，如细胞突起的长度、数量和分支情况等。记录并分析这些形态学特征的变 化，以评估神经细胞的生长和分化状态。
免疫荧光染色技术的应用
总结词
免疫荧光染色技术是一种有效的细胞标 记和检测方法，可用于神经细胞的功能 研究、受体定位和信号转导等方面。
VS
详细描述
通过免疫荧光染色技术，将特定的抗体标 记在神经细胞表面或胞内，利用荧光显微 镜观察染色情况。这种方法有助于研究神 经细胞的功能和受体分布，以及信号转导 过程中的分子定位。
神经细胞培养
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
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2）用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸
2 小胶质细胞的污染：预震荡的方法可以驱除大部分小 胶质细胞，或者在培养液加入 5mmol/l的L-亮氨酸甲酯， 两小时后可杀死小胶质细胞。 3 少突神经胶质细胞的污染：1 ）含血清培养； 2）在 传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理
GFAP
human Schwann cells
培养的方法：
1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒， 断头，置于培养皿中
2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮 质，去除嗅球等
3 去除脑膜，洗涤 （Hanks液） 4） 组织剪成碎块，37℃缓慢振荡约10 min。 5）重复过滤数次，收集细胞悬液，调整细胞 密度104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵 育箱培养
Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0．20
1．14 0．06 3．20 1．00 0．02 0．35 1．00 0．02
2．42 0．20 0．06 0．35
0．02
0．02
第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案
• 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养
缺点：1）仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染：为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者—配制培养基的器皿、 瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
6 常用的培养用液及培养基
• 培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、 组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密 度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新 的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。
2 细胞系培养
一 神经元的原代培养(Primary culture)
+
— + + —
—
— + +
—
+ + + —
125I-CYP
NG2 J1 Ia
Β-肾上腺能受体
300kDa蛋白聚糖 细胞黏附分子 Ⅱ型MHC抗原
+
— — + +
—
+ + +
—
+ + — —
利用细胞培养可研究胶质细胞 的特性
受体的表达 神经营养因子的分泌 酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取
髓鞘的形成
c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP， A2B5） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养
第12天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
五、神经元的纯化：
胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养液。
培养过程中注意事项
1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸
细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子
单层非神经细胞 单层的胶质细胞
2） 胰蛋白酶的作用时间： 3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液
三、培养操作过程
• 新生1～3d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净
工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥 除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min，
•吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
•用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1×106/ml细胞悬 液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放 置0.8х 0.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37℃培养。
四、神经元的鉴定：
神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数）
b 悬浮生长型细胞（少数）
2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O
9．00 0．42 0．25
8．00 0．20
6．80 0．40 0．20
8．00 0．40 0．14
8．00 0．20 1．10 0．10
8．00 0．40
0．20 1．56
0．20 0．06 0．06
3) 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
4) 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神 经和感觉神经的生长与存活； 脑源性神经营养因子 （brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周 和中枢特殊细胞群体的神经细胞； 硷性成纤维生长 因子（basic fibroblast growth factor, bFGF ) 等
缺点：不能表现出神经元分化的许多过程，
不能植入人体。
神经细胞系的建立： 1）动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养 （PC12） 2）将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分 离的细胞融合。
3）利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞， 使神经细胞获得永生。
Neuroblastoma cells on glass slide
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
二、胶质细胞的培养
胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞
研究胶质细胞的方法
1） 从未成熟的脑组织分离、培养获得 大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学 标志物。
三、神经细胞系培养
细胞系的生长过程： 有限细胞系：原代培养 无限细胞系：滞留期 传代期 衰退期 平台期
指数增长期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
系
８
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
神经肿瘤细胞系培养
优点：
容易生长、增殖速度快、实验操作简单等优点； 可以用液氮长期保存； 培养条件标准化； 可以导入外源基因；
一、组织来源： 1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期 蒲肯野细胞 ：胚胎末期 颗粒细胞： 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养
二、常用试剂
1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
• 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解
乳蛋白） 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
根据免疫组化反应分类：
Ⅰ型星型胶质细胞和Ⅱ型星型胶质细胞：
标志物 检测对象 Ⅰ型 形态 A2B5 GFAP 多聚唾液酸神经节苷脂 胶质纤维酸性蛋白 多角型 — + 细胞类型 Ⅱ型 星型 + + 少突胶质细胞 具有少量突起 + — —
Ran-2