神经细胞培养讲义

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
原代培养(primary culture):指从活体获得细胞、 组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture):当细胞持续生长到达一定密 度之后,就应当将细胞分成两部分(或更多)至新 的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。
2 细胞系培养
一 神经元的原代培养(Primary culture)
Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0.20
1.14 0.06 3.20 1.00 0.02 0.35 1.00 0.02
2.42 0.20 0.06 0.35
0.02
0.02
第 二节:神经细胞体外培 养的 基本概念和方案
• 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养
4 培养细胞的特性 1)培养细胞生长方式: a 贴附生长型细胞 (大多数)
b 悬浮生长型细胞(少数)
2)培养细胞生长特点:贴附;接触抑制;密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1)细胞的营养需要: a 基本营养物质 :氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子; b 营养因子等物质 2)细胞的生存环境: a 温度:哺乳动物和人类 为35~37℃;鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 :O2及 CO2的值: CO2=5%;PH=7.2~7.4 c 渗透压:260~320m mol/L
+
— + + —

— + +

+ + + —
125I-CYP
NG2 J1 Ia
Β-肾上腺能受体
300kDa蛋白聚糖 细胞黏附分子 Ⅱ型MHC抗原
+
— — + +

+ + +

+ + — —
利用细胞培养可研究胶质细胞 的特性
受体的表达 神经营养因子的分泌 酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取
髓鞘的形成
37℃培养1h
震荡(260rpm,18h)
收获贴壁细胞
第13天 贴壁的扁平细胞 非贴壁的,有突起的细胞, (前体细胞)
富含小胶质细胞
化学 限定 培养 含10%胎牛血清培养 富含Ⅱ型星型胶质 细胞 富含少突交质细胞
富含І型星型胶质细胞
神经胶质细胞分离和纯化流程
其他可选择的分离培养方案
1 低密度接种培养获得Ⅰ型胶质细胞——原理: 在低密度时神经元和产生Ⅱ型胶质细胞和少突 胶质细胞的前体细胞不能存活 优点:简单
3) 聚L -赖氨酸:处理培养皿(瓶)(10mg/L)5-10 min
4) 神经营养因子: 睫状神经营养因子( ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神 经和感觉神经的生长与存活; 脑源性神经营养因子 (brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周 和中枢特殊细胞群体的神经细胞; 硷性成纤维生长 因子(basic fibroblast growth factor, bFGF ) 等
3) 无污染及无毒:体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境!! 无毒:与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基,蒸馏水等; 间接接触者—配制培养基的器皿、 瓶盖、瓶塞等 无污染: 微生物及交叉污染
6 常用的培养用液及培养基
• 培养用液:水
平衡盐溶液(BSS)(见表) 消化液1胰蛋白酶液(0.25%) 2 二乙烯四乙酸二钠(EDTA) 3胶原酶
六、神经元的观察:
刚分离出的神经元呈圆形,用倒置显微镜观察有明显 的光晕。 •接种一般在2-6小时可贴壁;8小时已有纤细有突起长 出 •24小时后可见细胞体积开始增大,呈圆形或椭圆形。 生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕,立体感强, 突起以单、双突起为主 •培养至第4天,神经元胞体明显增大,形态多样,有些 具有分枝的突起, •培养7天后,神经元形态基本成熟,具有光滑的胞体, 发育良好的突起。
•吸收少许细胞悬液,用血球记数板快速计数细胞数,
•用含10%胎牛血清的DMEM培养基,稀释细胞制成1×106/ml细胞悬 液,接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内(板孔放 置0.8х 0.8cm的小盖玻片),放入5%CO2培养箱,37℃培养。
四、神经元的鉴定:
神经元特异性烯醇化酶( Neuron specific enolose NSE)、 微管相关蛋白(Microtubule associated protein MAP2) ——神经元,
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
2)用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸
2 小胶质细胞的污染:预震荡的方法可以驱除大部分小 胶质细胞,或者在培养液加入 5mmol/l的L-亮氨酸甲酯, 两小时后可杀死小胶质细胞。 3 少突神经胶质细胞的污染:1 )含血清培养; 2)在 传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理
GFAP
human Schwann cells
• 培养基:天然培养基(血清,血浆,组织浸出液,水解
乳蛋白) 合成培养基(MEM DMEM HAM`S F12 RPMI(1640) 199 L-15 )等
常用的平衡盐溶液(g/L)
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
培养的方法:
1)取材 生后1天的大鼠,75%酒精消毒, 断头,置于培养皿中
2)沿纵轴剪开皮肤和颅腔,取出大脑皮 质,去除嗅球等
3 去除脑膜,洗涤 (Hanks液) 4) 组织剪成碎块,37℃缓慢振荡约10 min。 5)重复过滤数次,收集细胞悬液,调整细胞 密度104~106/cm2接种于培养瓶,常规CO2孵 育箱培养
三、神经细胞系培养
细胞系的生长过程: 有限细胞系:原代培养 无限细胞系:滞留期 传代期 衰退期 平台期
指数增长期
20 原 代 培 养
18
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
16
无限细胞系
14
12
10
有限细胞系


0 2



10
12
24
34
44
培养时间(周)
神经肿瘤细胞系培养
优点:
容易生长、增殖速度快、实验操作简单等优点; 可以用液氮长期保存; 培养条件标准化; 可以导入外源基因;
NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O
9.00 0.42 0.25
8.00 0.20
6.80 0.40 0.20
8.00 0.40 0.14
8.00 0.20 1.10 0.10
8.00 0.40
0.20 1.56
0.20 0.06 0.06
三、培养操作过程
• 新生1~3d SD大鼠,麻醉后75%酒精浸泡消毒,断头后移入超净
工作台,无菌条件下开颅,快速取脑,置于D-Hanks液中,仔细剥 除脑膜和血管,小心剥离脑组织(海马),放入10ml小瓶中 •剪碎,加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱,定期振摇促消化。消 化约20min, •用含血清的DMEM培养液终止消化,吸管反复轻柔吹打,用200目 不锈钢筛网过滤,将滤液分散组成制成细胞悬液,1000rpm/min离心、 洗细胞两次,每次10min,
根据免疫组化反应分类:
Ⅰ型星型胶质细胞和Ⅱ型星型胶质细胞:
标志物 检测对象 Ⅰ型 形态 A2B5 GFAP 多聚唾液酸神经节苷脂 胶质纤维酸性蛋白 多角型 — + 细胞类型 Ⅱ型 星型 + + 少突胶质细胞 具有少量突起 + — —
Ran-2
GC GD3
3H-GABA
大鼠神经抗原-2
半乳糖脑苷脂 GD3神经节苷脂 GBBA摄取
缺点源自文库1)仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2) 成纤维细胞增殖能力更强 3)部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染:为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞(用抗纤维结合素(fibronection)的抗体鉴别) 1)预防为主;取材小于两天鼠,脑膜驱除干净,
缺点:不能表现出神经元分化的许多过程,
不能植入人体。
神经细胞系的建立: 1)动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养 (PC12) 2)将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分 离的细胞融合。
3)利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞, 使神经细胞获得永生。
Neuroblastoma cells on glass slide
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
二、胶质细胞的培养
胶质细胞 纤维性 的分类:a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞
研究胶质细胞的方法
1) 从未成熟的脑组织分离、培养获得 大量胶质细胞 2)已经开发出能识别胶质细胞的免疫学 标志物。
一、组织来源: 1) 种属: 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2)年龄:一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞:生后早期 蒲肯野细胞 :胚胎末期 颗粒细胞: 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养
二、常用试剂
1) 培养液 A DMEM : B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 2) D-Hank`液(其中可加入牛血清白蛋白3g/L)( HBSS)
(或者6 )移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单 细胞悬液 7) 加入完全培养基终止 8)接种3天后换液,以后每两天换液
9)传代, 0.25% 胰蛋白酶消化(覆盖细胞层即可) 或着用摇晃的方法
传代时注意事项:a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前,不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间;动作要轻柔,避免损伤细胞
神经细胞培养
第一节:细胞培养的基本知识
1定义: 组织培养 (Tissue culture ) :
细胞培养 (cell culture):
器官培养 ( organ culture):
统称为体外培养 (In vitro)
2 组织或细胞培养的优点: 1):研究对象是活细胞
2):研究条件可以人为的控制
3):研究的样本可以达到比较均一性 4):研究的内容便于观察、检测和记录 5):研究的范围比较广泛 6):研究的费用相对比较经济 7) :可作为一些遗传物质的运载细胞 8) :干细胞的广泛应用前景 3 组织或细胞培养的不足:1)与体内条件存在差 异 ;2)细胞培养存在一定的不稳定性
五、神经元的纯化:
胞嘧啶阿拉伯糖 ,培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养液。
培养过程中注意事项
1) 培养底物的处理: 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸
细胞外基质成分(胶原) 细胞黏附分子
单层非神经细胞 单层的胶质细胞
2) 胰蛋白酶的作用时间: 3)细胞合适的换液时间:大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液
神经的局部免疫反应 代谢过程
胶质细胞培养的局限性
1 大多来自于未成熟大脑,所以不能达到与体 内相一致的成熟程度,成年可能有干细胞的 存在。其形态可能随培养条件而发生变化。 2 存在不同的细胞亚群 3 其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。
培养用液
培养基:MEM400ml + 血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 – 青链霉素溶液8ml 葡萄糖-谷氨酰胺 –青链霉素溶液(100ml) :葡萄 糖 30g;谷氨酰胺 100mmol/l;青霉素 2.5X105U; 链 霉素 2.5X10 μg 胰蛋白酶:0.25%
原始数据图,颜色表示荧光强度
Neuroblastoma cells on silicon wafer
c 首次传代时细胞数量要多一些,使 细胞尽快适应新环境
鉴定:星形胶质细胞鉴定: 胶质原纤维酸性蛋白 (Glial fibrillary acid protein GFAP, A2B5) 少突胶质细胞 鉴定:GalC(ß -galactosidase)
第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养
第12天 预震荡(260rpm,1.5h)收获非贴壁细胞
相关文档
最新文档