生物技术制药-总复习

（2）限制酶：限制性核酸内切酶，是一类专一 性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA 分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。
（3）连接酶：能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA 连接酶。这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA 片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。
（4）同裂酶：识别不同的核苷酸序列，但切割后 产生相同的粘性末端，这样一类限制酶称同切口限 制酶或同裂酶。
▪ ⑦目的cDNA与载体DNA进行体外重组，构建重 组克隆载体。
▪ ⑧带有目的cDNA的重组载体转导进入宿主细胞。
▪ 作业五：
▪ 1、目的基因DNA与载体DNA体外重组的定向克 隆法和粘性末端连接法各有何特点？如何克服酶 切后同一DNA片段自身环化？
▪ （1）定向克隆法：当用两种不同的限制酶（如 用BamHⅠ和HindⅢ）消化同一DNA基因组时， 切下来的同一DNA片段带有非互补的突出末端， 这样供体DNA片段只能以一个方向很容易地连接 到同样用BamHⅠ和HindⅢ进行消化而产生相匹 配粘性末端的载体DNA当中。
▪ ④引入由多种限制酶单一识别序列组成的多克隆 位点。
▪ ⑤引入多种用途的辅助序列。
▪ 作业四：
▪ 1、名词解释（1）基因：将供体生物的DNA用限制酶切 成许多片段，在连接酶的作用下分别与克隆载体 进行体外重组，这种含有供体生物全部不同基生物的总mRNA为 模板，在反转录酶作用下合成核苷酸序列互补的 DNA（cDNA），将全部cDNA分别与克隆载体进 行体外重组，这些含有供体生物全部不同基因的 重组克隆载体的总体称供体生物的cDNA基因文 库。
▪ 作业二：
▪ 1、阐述生物药物的特性。 ▪ （1）药理学特性 ▪ ①治疗的针对性强，疗效可靠。 ▪ ②药理活性高。 ▪ ③毒副作用小，营养价值高。 ▪ ④生理副作用常有发生。 ▪ （2）在生产、制备中的特性 ▪ ①有效物质含量低，杂质种类多且含量高。 ▪ ②稳定性差，易变性、易失活。 ▪ ③易腐败。
▪ ④对环境条件敏感，生产条件的变化对产品质量 的影响较大。
▪ ⑤相对分子量较大，组成分复杂，常以多组分存 在，大多是复杂蛋白质的混合物。
▪ ⑥用量少，价值高。 ▪ ⑦注射用药有特殊要求。 ▪ （3）检验上的特殊性
由于生物药物具有特殊的生理功能，因此生 物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性 检验指标，这是生物药物生产开发的关键。
（5）限制酶星活性：在标准条件下，每种限制酶 都有严格的识别序列。在非标准条件下，会导致限 制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生 附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
（6）基因载体：在细胞内具有能进行自我复制的独 立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因 载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。 （7）粘粒：是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒， 由λDNA的cos区段与质粒DNA重组构建而成。
4、 PCR技术的基本程序。
▪ ①变性：首先使双链DNA在反应液中经热变性 （94~95℃）而分开成单链（或使反转录合成的 cDNA:RNA杂交链分开成单链）。
▪ ②退火：然后降温至40~60℃，在低温下与两个 引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合。
▪ ③延伸：再在中温72℃下利用Taq DNA聚合酶的 聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。
▪ ⑥当制备的克隆数多到足以把某种供体生物的全 部基因都包含在目的基因的DNA重 组体时就可以从中筛选而不必重复地进行全 部操作。
3、简述cDNA基因构建的基本步骤。 ①从供体生物细胞或组织中提取纯化得总RNA。 ②从总RNA中分离纯化出mRNA。 ③cDNA的合成。 ④cDNA选
①一种是限制酶错位切断DNA双链而形成彼 此互补的单链末端，称粘性末端。
②另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA 两条链而形成的双链末端，称为平整末端。 （4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别 序列。在非标准条件下，会导致限制酶识别序列 的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称 限制酶的第2活性或星活性。
▪ 特点：该法的优点是由于载体DNA片段两突出末 端不互补，不能自身环化，但与目的基因DNA片 段定向重组率却较高。
▪ （2）粘性末端连接法：用一种限制酶酶切，会 产生带有相同粘性末端的外源目的DNA片段，必 须与用同一种限制酶消化而形成具有相同匹配末 端的质粒载体相连接。
▪ 特点：质粒载体DNA和外源DNA片段都可能发生 自身环化，也有可能形成串联寡聚物。
▪ （3）用碱性磷酸酶去除载体DNA两端的5‵磷酸 基团以尽量减少载体DNA的自身环化或连接。经 去磷酸化的载体DNA仍然可有效地与具有5‵末端 磷酸的外源DNA相连接。
▪ 2、目的基因DNA与载体DNA体外重组的平端连 接法所用的合成街头和衔接头各有何特点？
▪ （1）合成接头是化学合成的两个自相互补的核 苷酸寡聚体（8~12bp），而两个寡聚体可形成带 一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体。 因此，在平整末端目的DNA上加合成接头可为其 增加一个以上限制酶酶切位点。从而易于与载体 末端相匹配而连接。
▪ （4）酶工程制药 是指利用游离或固定化的酶为 催化剂生产药物的技术。
主要研究酶的来源，酶的分离制备，酶的固 定化，酶反应器及相应操作条件的优化等。
▪ （5）生化工程制药 是指利用生化分离技术从生 物反应液或天然生物资源中提取分离制备药物的 技术。
主要研究药用生物资源的选择，药用成分的 种类、含量及其分布，药物的结构、性质及其提 取纯化工艺的优化。
②用特定的限制性内切酶将含有目的基因的供体 基因组DNA切割成许多片段。
③用能产生互补粘性末端的限制性内切酶将载体 （噬菌体）DNA切开并去除其中的填充片段。
▪ ④用专一性强的DNA连接酶将供体DNA片段分别 与载体DNA连接（供体DNA片段克隆到载体中）。
▪ ⑤经包装繁殖而产生重组噬菌体克隆、鉴定和克隆， 基因重组载体的构建与导入，目的产物的表达及 其分离纯化等问题。
▪ （3）细胞工程制药 在细胞和细胞器水平上对生 物的遗传物质改造的基础上，利用动、植物细胞 的大规模培养来生产药物的技术。
主要研究动、植物细胞高产株系的选育、培 养条件的优化、新型生物反应器的设计和应用以 及产物的分离纯化等问题。
▪ 2、生物技术制药涉及的技术领域
▪ （1）发酵工程制药 是指利用微生物的代谢过程 生产药物的技术。
主要研究微生物优良菌种的选育、发酵工艺 优化和产品的分离纯化等问题。
▪ （2）基因工程制药 是指利用重组DNA技术改造 生物物种的遗传物质结构，借助重组生物细胞以 生产药物或预防、治疗疾病的综合技术。
（3）PCR技术：聚合酶链式反应（Polymerose chain reaction）技术，简称PCR技术，是一种用 于在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段 的分子生物学技术。应用该技术可在很短的时间 内得到数百万个特基因的供体生物的细胞或组织 中提纯获得高质量的基因组DNA。
▪ （2）安全性评价 通过动物试验来鉴定其安全性。
▪ ①一般安全性要求：无菌、无病毒、无热原、无 致敏原等。
▪ ②药代动力学和毒理学研究。
▪ ③致突变、致癌和致畸等遗传毒理性质的考察。
▪ 作业三：
▪ 1、名词解释
（1）基因工程：又称DNA重组技术（DNA recombination technology），是指按人的意志， 将某一生物体（供体）的遗传信息（目的基因） 在体外经人工与载体DNA重组，构成重组DNA， 然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引 入的外源DNA片段（目的基因）在受体细胞内得 以表达和遗传。
4、 Taq DNA聚合酶有哪些特性和用途？ Taq 酶是一种耐热的DNA聚合酶。该酶具有
5‵→3‵聚合酶活力和依赖于聚合作用的5‵→3‵外切 酶活力。该酶最佳作用温度75~80℃。
该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于 PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子的特定序 列（目的基因）进行体外扩增。
5、基因载体有哪些特性？ ▪ ①要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区
▪ ⑥应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其 拷贝数。
▪ ⑦从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小 的宿主范围，不为传递性载体所诱导。
▪ 6、如何将天然的原始载体改造成理想的基因载 体？
▪ ①引入强启动子。 ▪ ②引入选择性标记基因。 ▪ ③切除大部分多余序列段，以提高容纳外源DNA
片段的能力。
中没有限制酶的酶切位点。 ▪ ②要含有强启动子，要有能促进外源DNA高水平
表达的调控区。
▪ ③要有多种限制酶的单一切点，以适用于多种限 制酶产生的DNA片段的插入。
▪ ④具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作 为对重组与非重组转化体的选择标记。
▪ ⑤载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较 长区段的外源DNA片段。
引物应是与目的基因3‵端互补的核苷酸序列。
▪ ⑤延伸：升至中温72℃，在反应体系中（扩增缓 冲液）加入Taq 聚合酶和四种dNTP，分别以目 的mRNA和目的cDNA单链为模板进行聚合（延 伸）反应。
▪ 如此按变性、退火、延伸进行约30次重复循环， 得到目的cDNA大量拷贝（10 6倍）。
▪ ⑥从反应液中分离提取出双链目的cDNA扩增产 物。
2、基因工程技术的优点。 （1）它能从极其复杂的各种生物细胞内获得所需的 目的基因，并将此目的基因在体外进行剪切、拼接、 重组，并转入到受体细胞中，从而合成出人们所需 的新产物。
（2）它能使带有各种各样遗传信息的DNA 片段 越过不同生物物种间特异的细胞壁而转入到完全 不同的生物体内，定向地控制、修饰和改变受体 的遗传和变异，从而创造出自然界所未有的具有 新的遗传性状的生物新种，并增产出数百数千倍 人们所需的生物新药。 3、限制酶有哪些特性？ （1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷 酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）。 （2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构。 （3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切 后形成各种粘性或平整末端。