ips细胞的有关实验

燕山大学

课程设计说明书

小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究学院（系）：环境与化学工程学院

年级专业： 08级生物化工

学号： 080110050051

学生姓名：周纪

指导教师：赵红卫

教师职称：讲师

燕山大学课程设计（论文）任务书

院（系）：环境与化学工程学基层教学单位：生物工程系

年月日燕山大学课程设计成绩评定表

2010-2011秋季学期

生物工程专业课程设计

结题论文

小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究

学院（系）：环境与化学工程学院

年级专业： 08级生物化工

学号： 080110050051

学生姓名：周纪

指导教师：赵红卫

教师职称：讲师

摘要

本设计用SOL处理小鼠成纤维细胞使细胞膜穿孔，再将小鼠胚胎干细胞提取液替代SOL，小鼠与成纤维细胞孵育合适的时间。这样胚胎提取液中的活性因子就可以通过小孔进入成纤维细胞，从而介导细胞的重编程，进一步获得小鼠的多功能性细胞（IPS细胞）。本设计的对照组是只用SOL液与成纤维细胞孵育和只用胚胎干细胞提取液与成纤维细胞孵育。在对IPS细胞进行鉴定的中，首先通过从细胞的形态学进行鉴定。IPS细胞与ES 细胞相类似，具体表现为细胞呈集落样生长、集落致密且边缘整齐、细胞形态较小。而只有形态学的鉴定远远不够，故通过对细胞的流式细胞学的检测最终确定被诱导的细胞是否具有ES细胞的特性。流式细胞学的检测是通过流式细胞仪检测ES细胞的分子标志蛋白在目标细胞中是否成阳性来判断目的细胞是否表达ES细胞的分子标志蛋白，从而确定目的细胞是否具有ES细胞的特性。

关键词：胚细胞提取物；IPS细胞；细胞冲编排

目录

第一部分：文献综述

1.1 IPS细胞的研究方法及进展 (1)

1.2 从小鼠到人的突破 (1)

1.3 转录因子的优化 (1)

1.4 证实IPS细胞的全能性 (2)

1.5IPS细胞发展的重大事件 (2)

2. 细胞重编排的机理 (4)

3. 相关的转录因子 (5)

3.1 Oct3/4 (5)

3.2 sox2 (6)

3.3 c-Myc (6)

3.4 Klf4 (6)

3.5 Nanog (7)

3.6 Lin28 (7)

4. 细胞提取物介导的细胞重编程的方法 (8)

4.1 转化法 (8)

4.2 用两栖动物的生殖细胞因子进行重编程 (8)

4.3 胚胎干细胞和胚胎癌细胞的提取物进行体细胞重编程 (9)

5.胚胎干细胞特异性分子标志 (9)

5.1 小鼠和人的分子标志蛋白 (9)

5.2 ES细胞特异性分子标志的功能 (10)

6.总结——本设计的研究宗旨及意义 (11)

第二部分：实验设计部分

1.材料 (12)

1.1实验药品 (12)

2. 方法 (13)

2.1 小鼠胎提取液的制取 (13)

2.2 小鼠成纤维细胞的获取 (14)

2.3 维细胞的的传代 (14)

2.4 用小鼠胚胎提取液处理小鼠成纤维细胞 (14)

2.5 IPS细胞的鉴定 (14)

3.设计 (15)

3.1 用小鼠胚胎提取液诱导小鼠成纤维细胞转化为IPS细胞 (15)

3.2 IPS细胞的鉴定 (15)

4.分析与总结 (15)

5.设计体会 (16)

参考文献 (17)

第一部分文献综述

1.诱导性多潜能干细胞（IPS细胞）的发展历程

1.1 IPS细胞的研究方法及进展

2006年，Takahashi等通过巧妙的实验设计，从24个候选基因中通过系统排出过程，先删减到10个基因，从这10个基因中观察去除哪个对细胞克隆数影响最大而最终筛选出4个与胚胎干细胞多能性更为密切的基因——Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4，用逆转录病毒将4个基因转入小鼠胚胎成纤维细胞和成体鼠尾成纤维细胞，置于STO字样层细胞共培养。成功地将原成纤维细胞重编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞。

1.2 从小鼠到人的突破

2007年年底关于IPS细胞的研究有了从小鼠到人的突破，又掀起了又一次IPS 细胞的研究高潮。日本京都大学Yamanaka研究小组及没过威斯康辛大学Thomson 研究小组通过独立研究，同时成功地利用人体表皮细胞制造出了类ES细胞。这次人体皮肤细胞“直接改造技术”跨越伦理障碍，令在实验室中培育出人造人体器官的梦想更近了一步。

1.3 转录因子的优化

四种转录因子又到体细胞转变为多能干细胞的机制还不是很清楚，并且先前的IPS细胞诱导技术带有致癌基因c-Myc而备受关注。2008年1月 Yamanaka 小组和Jaenisch小组利用Oct4、Sox2和Klf4 3种基因将鼠和人成纤维细胞重编程为更安全的iPS细胞，2008年4月Jaenisch 小组运用Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 和C-EBPα将终末分化的鼠成熟B细胞重编程为iPS细胞。2008年6月1 Sch ler小组利用Oct4 和Klf4 2 种基因将鼠神经干细胞重编程为iPS 细胞。这使转录因子越来越少而且一些容易引起细胞发生癌变的基因也被一些其他的基因所代替，这是细胞基因突变和癌变的概率大大降低。这使IPS细胞的安全性大大提高。

1.4 证实IPS细胞的全能性

尽管目前的IPS细胞在很多方面都与ES细胞相似，但是却都没有通过最严格的多能性检测。因此很多人对IPS细胞是否具有足够的潜能产生所有机体组织产生质疑。直至2007年7月我国科学家首次用IPS细胞培养出哺乳动物。证实了IPS细胞的全能性。

1.5 IPS细胞发展的重大事件

2006 年8 月，Yamanaka 小组将24 种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定少有4 种转录因子组合——Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 即可将成纤维细胞重编程为iPS细胞，2007 年11～12 月，Yamanaka 小组和Thomson 小组先后将人的体细胞重编程为iPS 细胞。

2006-08-25 Yamanaka 小组利用Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种基因将小鼠成纤维细胞诱导为iPS 细胞。

2007-11-30 Yamanaka 小组利用Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种基因将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞。

2007-12-21 Thomson小组利用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4 种基因将人的体细胞重构为iPS 细胞2007-12-21 Jaenisch 小组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗镰状红细胞贫血，这从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定基础。

2008-01-00 Yamanaka小组和Jaenisch小组利用Oct4、Sox2和Klf4 3种基因将鼠和人成纤维细胞重编程为更安全的iPS细胞。

2008-01-10 Daley小组运用4种或6种因子组合将多种人体细胞(不同来源或处于不同发育阶段)重编程为iPS细胞。

2008-04-15 Jaenisch 小组证实鼠iPS细胞来源的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠脑内，可有效缓解其症状和改善其行为, 说明iPS 对复杂疾病治疗的可能性。

2008-04-18 Jaenisch 小组运用Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 和C-EBP琢将终末分化的鼠成熟B细胞重编程为iPS细胞。

2008-06-05 Ding小组利用Oct4和Klf4 与G9a 组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294 (BIX)组合将神经干细胞高效率重编程为iPS细胞。

2008-06-24 Hochedlinger小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4 种基因将