酶促动力学-生物化学实验

Km(1+[I]/Ki)/Vm Km/Vm
(1+[I]/Ki)/Vm
(1+[I]/Ki)/Vm
-1/Km
-(1+[I]/Ki)/Km
酶的分类
1、氧化还原酶（oxidoreductase） 2、转移酶（transferase） 3、水解酶（hydrolase） 4、裂解酶（或裂合酶lyase） 5、异构酶（isomerase） 6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）
最适 pH 1.8 7.6 7.7 7.8 7.8 9.8
四、温度对酶促反应速度的影响
五、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶 活性降低或丧失。 抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的 物质。
不可逆抑制（irreversible inhibition）
抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使 酶丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂 使酶恢复活性.
• 非竞争性抑制作用过程：
S E
ES
E+P
I
I
I E
S
I ES
•非竞争性抑制的动力学方程:
1 v
=
VKmmax(1+
[I] Ki
)
1 [S]
+
1 Vmax（1+
[I] Ki
）
•非竞争性抑制的特征曲线：
1 v

[I]
1
[I]
Vmax (1+ Ki )
正
常
-1
1
Km
[S]
•非竞争性抑制的特点：
1、I与S分子结构不同； 2、Vmax 减小，表观Km不变； 3、抑制程度取决于[I]大小。
注：表1～表3中，基质液即底物液（磷酸苯二钠） 表1
1. 加入酶液立即计时，迅速混匀置37℃水浴15min。 注意：酶促反应开始，从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反 应时间应准确一致，均为15分钟。 2. 保温后各管立即加入0.5M NaOH溶液1.0ml，快速混匀，防止局部浓度过高。 3. 各管混匀之后再分别加入0.3%4-AA1.0ml及0.5%K3Fe（CN）62.0ml，混旋仪充分 振荡混匀，使显色完全。室温放置10min后以6号管校正零点，在分光光度计中比色 (λ=510nm) 注意：必须立即混匀，否则显色不完全。
• 底物浓度[S] • 酶浓度[E] • 反应温度 • pH 值 • 抑制剂 • 激活剂
一、底物浓度对酶促反应速度的影响
E+S k1 k2
ES k3 E+P
中间产物学说
v
Vm
0.3
0.2
[S]与v关系：
Vm
当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应
2
当[S]较高时，[S]与v不成比例
例1： 巯基酶的抑制
SH E + Hg2+
SH
SH Cl E + As-CH=CHCl
SH Cl 巯基酶 路易士气
S
E
Hg + 2H+
S
S E As-CH=CHCl + 2HCl
S
可逆抑制(reversible inhibition)
抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶 活性的降低活丧失, 结合是可逆的, 能够通 过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。
品系的遗传性差异。
表2 以下操作同表1步聚中1、2、3、步
表3 以下操作同表1步聚中1、2、3、步
• 拓展
1、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离， 纯化，理化特性分析研究。
2、纯化酶可进行结构、序列分析。 3、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。 4、可进行酶的细胞化学定位。 5、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、
生物化学与分子生物学实验
特点：独立性，广泛应用性。 范畴： •几种常用生物大分子制备技术 •光谱技术、层析技术、电泳技术、离心技术 •放射性同位素技术 •分子克隆、外源基因表达、分子杂交 要求：
实验报告书写
实验目的： 原理： 操作： 结果： 分析/讨论： 注意事项：
实验七 酶促反应动力学实验
Enzyme; Ribozyme
[I] 正常
1 [S]
竞争性抑制的特点：
• I与S分子结构相似； • Vmax 不变，表观Km增大； • 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，
以及[I]和[S]的相对浓度比例。
（二）非竞争性抑制 （non-competitive inhibition）
• 概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部 位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争 关系。
1/V
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax -1/Km 0
1/[S]
二、酶浓度对酶促反应速度的影响
三、pH对酶促反应速度的影响
酶
的
A
B
活
性
2
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶
酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。
一些酶的最适 pH 值
酶 胃蛋白酶 过氧化氢酶 胰蛋白酶 延胡索酸酶 核糖核酸酶 精氨酸酶
Kinetics of enzyme-catalyzed reaction
酶促反应动力学
概念：
• 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及 其影响因素。
• 反应速度：单位时间内底物减少或产物 增加的速度，常用初速度来衡量。
初速度
产 酶促反应速度逐渐降低
物
0
时间
酶促反应的时间进展曲线
影响酶促反应速度的因素：
4. Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与 酶浓度呈正比；
5. k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和 时，单位时间内每个酶分子（或活性中 心）催化底物转变为产物的分子数。 1~10 4/s
Km值与 Vmax值测定
双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）
1
Km 1
1
=
+
V Vmax [S] Vmax
思考题：
1、概念：酶、酶活性、反应初速度、酶活性 中心、必需基团、Km、最适温度、最适 pH、竞争性抑制、
2、比较竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争 性抑制作用特点及林-贝氏图；简述竞争性 抑制的理论和实际意义。
可逆性抑制作用的动力学比较
作用特点 无抑制剂
竞争性抑制
• 与I结合组分
• 动力学参数
表观Km
可逆抑制类型：
竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制（non-competitive inhibition） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）
(一)竞争性抑制(competitive inhibition) • 概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相 似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而 影响E与S的结合。
0.1
当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
0 1 2 3 4 5 6 7 8 [S]
米---曼氏方程 （Michaelis-Menten equa+ [S]
米-曼氏方程解释： 当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S] 当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v不变
S E
I
ES
v 无I 有I
EI
E+P
• 竞争性抑制作用过程
[S]
• 竞争性抑制的底物浓度曲线
• 竞争性抑制的动力学方程:
v=
Vmax[S] Km(1+[I]/Ki)+[S]
1 v
=
VKmmax(1+
[I] Ki
)
1 [S]
+
1 Vmax
• 竞争性抑制的特征曲线： 1 v
1 Vmax
-1
-1
Km
[I] Km(1+ Ki )
Km
表观Vm
Vm
• 双倒数作图
斜率
Km/Vm
纵轴截距 1/Vm
横轴截距 -1/Km
E
Km(1+[I]/Ki) Vm
Km(1+[I]/Ki)/Vm 1/Vm 1/Km(1+[I]/Ki)
非竞争性抑制 E、ES
反竞争性抑制 ES
Km Vm/(1+[I]/Ki)
Km/(1+[I]/Ki) Vm/(1+[I]/Ki)
矩形双曲线：
v
v =（Vm/Km） [S] v=Vm=K3[E]
V= Vmax [S]
Vm
Km + [S]
2
Km
[S]
底物浓度对酶促反应速度的影响
Km与 Vmax的意义
1. Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度； 2. Km可用来表示酶对底物的亲和力大小， Km
与酶对底物亲和力大小成反比；
3. Km值是酶的特征性常数之一， Km值范围在10-6 ~ 10-2mol/L