化学遗传学方法.PPT

第三节 化学遗传学方法
二十年前，编码蛋白的发现引起了细胞周期调节领域 的一场革命。它们作为重要的信号传导组分的确认加 速了在这个领域的研究，为进一步生物化学研究提供 了必要的起点。在近些年，生物活性的小分子化合物 已经在细胞生物学中起到类似的作用，化学生物学这 一新领域把那些致力于了解和模拟自然世界的化学家 和生物学家带到一起。 1994，哈佛大学的Tim Mitchison[1]教授在首期的 “Chemistv &Bio1ogy"《化学和生物学》上阐述了 化学遗传学(chemical genetics)的基本概念。他指出 要探索生命过程必须有干扰生命过程的手段，然后才 能了解其后果。随后，哈佛大学stuart L.Schreiber教 授和Tim Mitchison教授开始利用小分子来系统地探 索细胞和蛋白质的生理功能。
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1、酶标仪
酶标仪是一种用途广泛的生 物检验医疗设备，利用酶联 免疫分析法，根据酶标记原 理，根据呈色物的有、无和 呈色深浅进行定性或定量分 析。 这是一种极具生命力的免疫 学技术。可用于单克隆抗体 筛分、凝血分、抗生素灵敏 度检验，以及其它需要进行 比色的分析工作中。
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按照功能的划分，酶标仪可以分为光吸收酶标 仪，荧光酶标仪，化学发光酶标仪和多功能的 酶标仪。光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫 外光吸光度的检测。 特定波长的光通过微孔板中的样品后，光能量 被吸收，而被吸收的光能量与样品的浓度呈一 定的比例关系，由此可以用来定性和定量的检 测。 光吸收的检测技术成熟，成本低，操作简单， 但是动态范围窄，灵敏度比较低，特异性不强。 一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为 光源，而紫外/可见酶标仪是可以将两种光源 进行切换，适应不同测量波长的需求。
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1，小分子化合物库的构建-高 通量合成和制备
过去，生物活性小分子主要是从生物有机 体中发现的，但是，很可能它被认定的活 性是由于机体内许多化合物的协同作用造 成的，而不仅仅取决于这一小分子。为了 克服这一困难，需要构建包含大量具有确 定结构的小分子化合物库。
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2，生物活性的检测-高通量筛选
在过去，从万个化合物中筛选具有生物活性的小分子 化合物是比较烦琐和困难的，高通量筛选是指运用自 动化的筛选系统在相对短时间内，通过特定的生物模 型来对成千上万化合物进行活性筛选。现在人们可以 尽可能采用自动的方式利用96、384或1536孔板进行 生物活性分子的筛选（图a）。 在设计化学遗传学适合的筛选方法过程中，首先要确 定是采用哪种化学遗传学方法，即正向还是反向化学 遗传学方法，以便选择“纯蛋白”、“细胞”或“胚 胎”检测方式(图b)。筛选过程首先是确定生物活性靶 点以及检测活性的方法，然后再设计相应的用于高通 量筛选的平台。为了确保高通量筛选结果的有效性， 所用的检测方法必须灵敏，而且重复性好。
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在“化学遗传学”出现的同时，又出现了“化学基因组 学”的概念。两者的研究思路、内容基本相同，只不过 化学基因组学在化学遗传学及化学蛋白质组学的基础上 又向前一步，研究与人类疾病密切相关基因的生物功能。 考虑到本书中很少涉及到基因组学内容，因此，主要介 绍化学遗传学方法。 化学遗传学与传统的遗传学在思路上有相通之处，它还 可以分为正向化学遗传(forward chemical genetics) 和反向化学遗传(reverse chemical genetics)。 前者用动物细胞、微生物以及它们的裂解产物来寻找对 生物过程产生影响的小分子，并确定相应的蛋白靶；后 者则是先高表达某种蛋白，寻找与蛋白结合或影响纯蛋 白的功能的小分子，再对找到的小分子在体内进行对此 蛋白的功能影响实验。
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高通量药物筛选的检测系统快速、高灵敏度的 检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。 在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪 计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光 度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断 提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很 好的检测效果。 常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学 特点分为以下几类：①受体结合分析法。②酶 活性测定法。③细胞因子测定法。④细胞活性 测定法。⑤代谢物质测定法。⑥基因产物测定 法等等。
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高通量筛选技术
高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形 成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验 方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动 化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采 集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处 理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测， 并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。 分子水平和细胞水平的实验方法(或称筛选模型)是实 现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选 要求同时处理大量样品，实验体系必须微量化。这些 微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改 进建立的，更多的是根据新的科学研究成果建立的。
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化学遗传学采用小分子活性化合物作为探针，以多种方 式影响靶蛋白的功能，探索和控制细胞过程。从另一方 面来说，化学遗传学研究所获得的成果-小分子化合物 及其生物学效应，除了被用来揭示生命的基本活动规律 外，还可能成为候选药物。 也就是说化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究， 而与应用紧密相联。所以很多大型制药公司都非常关注 化学遗传学。 例如，哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的 “化学与细胞生物学研究所”时，著名的默克制药公司 （Merck）就成为了该所的主要赞助者之一。可以说， 化学遗传学的出现把传统的学术研究实验室引进了药物 开发的战场。
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一、化学遗传学的基本方法
根据人类基因组的草图，基因的表达产物-蛋白质的数 量在100，000到数百万个，其中大部分属于目前还不 清楚的未知蛋白质，而化学遗传学通过使用小分子作为 探针研究细胞内或完整组织中蛋白质的功能，通过这些 分子探针作用模型的生物化学解释，有助得到关于复杂 细胞过程中蛋白质功能的新信息。 化学遗传学的第一个关键环节是合成可供筛选的小分子 库，第二个关键环节是发展准确、高速和低成本的化键环节是确证筛选得到的化合物结构，并确认蛋白 标靶以及优化化合物的蛋白亲和性。