蜂毒肽@ZIF-8纳米载药体系的构建及抗肿瘤活性研究

蜂毒肽@ZIF-8纳米载药体系的构建及抗肿瘤活性研究
天然生物毒素蜂毒肽（Melittin,MLT）为蜂毒的主要成分,是一种由26个氨基酸组成的两亲性多肽,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤等。

蜂毒肽在抗肿瘤方面具有独特的优势,它可以直接攻击肿瘤细胞,通过裂解肿瘤细胞膜来增加细胞膜的间隙,破坏磷脂膜的完整性,使得细胞内容物外溢,引起细胞死亡。

同时,研究表明蜂毒肽经过胞内递送后还可通过类似的方式作用于胞内细胞器,诱导生化变化或转录调节,它对肿瘤细胞的多种功能均可产生影响,包括抑制增殖、诱导凋亡、抑制转移和血管生成及阻滞细胞周期等,为未来的肿瘤治疗提供了广阔的前景。

然而,蜂毒肽强烈的溶血性和非特异性细胞毒性,以及易变性、体内降解快、半衰期短等问题均严重阻碍了其临床应用。

因此,如何做到减毒增效,将蜂毒肽有效递送至肿瘤组织,并降低其对正常组织细胞的毒性,对于其临床应用具有重要意义。

纳米载药体系能够有效发挥材料对药物的保护作用,协助药物跨越黏膜屏障,通过高通透性和滞留（Enhanced permeability and retention,EPR）效应增强药物在靶点部位的累积,改变药物在体内的分布,减少系统性毒性,目前已成为现代药物研究的重要方向。

金属有机框架（Metal–organic frameworks,MOFs）是一种新兴的多孔杂化材料,与传统的纳米材料比较,MOFs具有可调节的组成和拓扑结构、高度有序的孔隙、大的表面积以及优良的物理和化学性质,被广泛用于催化、化学传感、气体吸附等多个领域,尤其在药物装载和输送方面备受关注。

沸石咪唑酯骨架-8（Zeolitic imidazolate frameworks-8,ZIF-8）是MOFs材料中最具有代表性的一种,其骨架结构是由金属Zn离子与二甲基咪唑中的N原子相连形成的四面体结
构。

除了具备MOFs的优势外,ZIF-8还具有更好的载药能力、更高的热稳定性、化学稳定性、良好的生物相容性以及灵敏的pH响应性,它在中性生理条件下结构保持稳定,而在肿瘤组织弱酸性的细胞环境中发生分解,使负载药物在肿瘤部位实现可控、精准释放,满足新型纳米载药体系在载药量、稳定性及药物释放等多方面的要求。

利用纳米载体递送的方法被认为是改善蜂毒肽癌症治疗效果的最佳策略之一。

因此,本研究选择ZIF-8纳米材料作为蜂毒肽的载体材料构建纳米载药体系,实现其减毒增效治疗。

本研究主要包括以下三方面工作:1.蜂毒肽@ZIF-8纳米粒的制备及表征本研究建立了蜂毒肽@ZIF-8纳米粒（MLT@ZIF-8 NPs）在水体系中“一锅搅拌法”的绿色制备方法,并通过SEM、TEM、DLS测定等表征手段证实得到的纳米粒为规则的菱形十二面体结构,分散性好,单分散纳米粒的粒径尺寸均在100 nm左右;通过PXRD、红外、表面电势测定等方法确定了ZIF-8晶体的成功合成和蜂毒肽的有效载入;通过TGA和BCA蛋白测定法确定MLT@ZIF-8 NPs中蜂毒肽的载药量为6.9%,包封率为25.5%;MLT@ZIF-8 NPs在不同pH条件下的药物释放实验结果显示,MLT@ZIF-8 NPs在中性生理条件（pH 7.4）下能够保持稳定,而在模拟肿瘤细胞内部的微酸性环境（pH 6.8和5.5）中,药物释放率明显升高,说明ZIF-8材料具备优良的pH敏感性,能够在微酸性的环境中发生崩解,有效释放负载药物;MLT@ZIF-8 NPs在室温水溶液和37^oC模拟生理条件下（含有10%FBS的PBS缓冲液）的稳定性测试结果显示,MLT@ZIF-8 NPs在这两种溶液中的粒径和聚合物分散指数（PDI）在7天内均保持基本不变,说明
MLT@ZIF-8 NPs具有良好的尺寸稳定性,这对于纳米粒的储存和实际应用具有重
要意义;体外溶血实验结果显示,游离蜂毒肽自身具有很强的溶血性,在8μg/mL 的给药浓度下即可引起约90%的溶血,而MLT@ZIF-8 NPs负载的蜂毒肽浓度达128μg/mL时,仍然具有较低的溶血活性（8%）,说明利用ZIF-8纳米材料包封的方法能够有效降低蜂毒肽对红细胞的溶血活性,减少其对正常组织细胞的非特异性细胞毒性,提高药物体内递送的安全性。

2.蜂毒肽@ZIF-8纳米粒体外抗肿瘤活性评价及机制研究为评价MLT@ZIF-8 NPs的体外抗肿瘤作用,本研究采用MTT测定法检测了MLT@ZIF-8 NPs对肿瘤细胞增殖活性的影响。

结果表明,与游离蜂毒肽相比,装载等量蜂毒肽的MLT@ZIF-8 NPs对于两种肿瘤细胞（A549细胞和HeLa细胞）的增殖均显示出更强的抑制作用,其中MLT@ZIF-8 NPs和游离蜂毒肽对于A549细胞增殖抑制的IC₅₀值分别为6.7和8.2μg/mL,二者对于HeLa细胞的IC₅₀值分别为4.2和4.8μg/mL,说明将蜂毒肽载入ZIF-8框架结构内制成纳米药物能够有效增强其体外抗肿瘤活性;通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测纳米粒体外细胞摄取的实验结果表明,MLT@ZIF-8 NPs能够被A549肿瘤细胞有效摄取进入细胞内部,且细胞摄取行为呈现时间依赖性和剂量依赖性;通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测纳米粒诱导细胞凋亡的实验结果表明,MLT@ZIF-8 NPs能够诱导A549细胞发生凋亡,且随着给药浓度的增加,细胞凋亡比例明显升高,而不同浓度的游离蜂毒肽作用于A549细胞后,细胞变化则以坏死为主,提示二者对于肿瘤细胞的作用机制有所不同;为了进一步探讨MLT@ZIF-8 NPs的抗肿瘤作用机制,本课题利用基因芯片技术分析MLT@ZIF-8 NPs作用于A549细胞后的基因表达变化情况,差异表达基因筛选结果显示,MLT@ZIF-8 NPs作用于肿瘤细胞后共产生3383个差异表达基因,其中上调表达的基因1945个,下调表达的基因1438个;对筛选出来的差
异基因进行Gene Ontology（GO）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析,从而研究差异变化基因的作用网络,其中GO 富集分析从生物过程、细胞组成和分子功能三方面较全面地概括了差异表达基因的功能信息,KEGG通路富集分析结果显示差异表达基因富集最多的通路为Pathways in cancer（与癌症相关的通路）,进一步对富集于Pathways in cancer 中的差异表达基因进行分析,发现在这些差异表达基因中包括p53和PI3K两个基因,结合KEGG富集分析结果,提示p53和AKT通路可能参与到MLT@ZIF-8 NPs对A549细胞增殖抑制作用的调控过程中;采用Western Blot检测MLT@ZIF-8 NPs 作用后A549细胞中p53和AKT通路相关蛋白的表达变化,结果显示,MLT@ZIF-8 NPs作用于肿瘤细胞后,p53蛋白表达上调,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cytc、Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bax/Bcl-2比例升高,PI3K和p-AKT蛋白表达下调,p-AKT/AKT比例降低,这与基因芯片分析结果一致,说明MLT@ZIF-8 NPs对A549肿瘤细胞增殖的抑制作用及诱导凋亡的分子机制可能与PI3K/Akt调节的p53信号通路相关。

3.蜂毒肽@ZIF-8纳米粒体内抗肿瘤作用研究本研究建立了两种荷瘤小鼠模型（免疫缺陷动物BALB/c裸鼠的A549皮下肿瘤模型和正常免疫力动物昆明鼠的U14皮下肿瘤模型）来评价MLT@ZIF-8 NPs的体内抑瘤作用,并通过血液生理生化指标检测评价纳米药物的体内安全性。

实验结果表明,MLT@ZIF-8 NPs在这两种荷瘤小鼠模型中均能够显著抑制体内肿瘤的生长,并且都显示出比游离蜂毒肽更好的抑瘤效果,其中,BALB/c裸鼠的A549皮下肿瘤模型中MLT@ZIF-8 NPs和蜂毒肽的抑瘤率分别为84%和59%,昆明鼠的U14皮下肿瘤模型中MLT@ZIF-8 NPs
和蜂毒肽的抑瘤率分别为71%和49%,说明将蜂毒肽载入ZIF-8框架结构内制成纳
米药物能够有效增强其体内抗肿瘤作用;两种荷瘤动物模型中各组小鼠的离体肿瘤组织病理切片结果显示,单独蜂毒肽给药组和MLT@ZIF-8 NPs给药组肿瘤切片均显现出不同程度的肿瘤组织坏死样改变,并且MLT@ZIF-8 NPs给药组肿瘤组织中死细胞最多,瘤体坏死程度最重,说明MLT@ZIF-8 NPs在体内治疗中对于肿瘤组织具有更强大的杀伤作用;生理生化指标检测结果显示,小鼠在MLT@ZIF-8 NPs
给药后不同时间点的血常规测试参数和血清生化指标检测结果均在正常范围内,与对照组相比无显著性差异,说明MLT@ZIF-8 NPs在当前给药剂量下无明显的毒副作用,不会影响主要脏器的正常功能,可以安全有效地用于体内抗肿瘤治疗。

综上,本研究以新型纳米多孔材料—ZIF-8材料作为蜂毒肽的药物递送载体,成功构建了pH响应型蜂毒肽@ZIF-8纳米载药体系。

通过将蜂毒肽载入ZIF-8框架结构内制成纳米药物,不仅很好地解决了蜂毒肽的溶血性和非特异性作用的问题,而且有效增强了其体内外抗肿瘤作用,MLT@ZIF-8 NPs的抗肿瘤作用机制可能与PI3K/Akt调节的p53信号通路相关。

本研究为蜂毒肽临床上作为抗癌药物的应用提供了新的思路和发展方向,也为开发其他生物毒素资源及开展它们的减毒增效研究奠定了基础。