毕赤酵母表达系统使用心得
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
&’()1!、 &’()1!2 和 &’()1!) 等 ； 分 泌 表 达 的 载 体 有 0% 、 &’()3 、 &’()3+、 &!)"45- 、 &’()1!!、 &’()1!2 、 &’()1!) 和 &$(.
有一个外源基因 /65 等。通用的整合载体多含有 ! "#$ 启动子 ， 和一个从 ! "#$ 基因上拷贝下来的 终 表达框、 多克隆位点（ %&’ ） ， 作 为 筛 选 标 记 的 ()*+ 基 因 和 在 细 菌 中 进 行 复 制 起 止序列（ 77） 始点和选择标记（ 如 )89:5 复 制 起 始 点 和 抗 氨 苄 青 霉 素 基 因 ） 以 使外源基因能以同源重组的方式整 及 ! "#$ *;的非编码区序列， 合到染色体的 ! "#$ 部位（ 表 5） 。
［ 4’5 6/$+)］ D(>?(1 @1AB2C(A _ G]YKGIIDPT WGEJ/KI_ G]YKGIIDPT YK/JGDP
Y/IGS1 [DPM00L7 M VKDGN I6HHMKL MV/6J JFG G]/TGP/6I YK/JGDP G]YKGIID/P DP D(>?(1 @1AB2C(A XMI YKGIGPJGS1
(D/EFGHDIJKL %JMNNK//H7 OMPQDG RGSDEM0 */00GTG7 UDV/ 8??82@7 *FDPM
［ ,3)&$#%&］ #FDI KGWDGX YKGIGPJGS M E/HYKGFGPIDWG DPJK/S6EJD/P J/ JFKGG F/IJ VMEJGKDM /N Z(>?(1 @1AB2C(A /KDTDPMJDPT NK/H
毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用
写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。
它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。
目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。
毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。
此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。
因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。
例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。
毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。
比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。
利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。
总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。
毕赤酵母表达系统的绝好综述文献共享
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeastPichia pastorisJoan Lin Cereghino,James M.Cregg*Department of Biochemistry and Molecular Biology,Oregon Graduate Institute of Science and Technology,20000N.W.Walker Road,Beaverton,OR97006-8921,USAReceived25July1999;accepted4September1999AbstractDuring the past15years,the methylotrophic yeast Pichia pastoris has developed into a highly successful system for the production of a variety of heterologous proteins.The increasing popularity of this particular expression system can be attributed to several factors,most importantly:(1)the simplicity of techniques needed for the molecular genetic manipulation of P.pastoris and their similarity to those of Saccharomyces cerevisiae,one of the most well-characterized experimental systems in modern biology;(2)the ability of P.pastoris to produce foreign proteins at high levels,either intracellularly or extracellularly;(3)the capability of performing many eukaryotic post-translational modifications,such as glycosylation,disulfide bond formation and proteolytic processing;and(4)the availability of the expression system as a commercially available kit.In this paper,we review the P.pastoris expression system:how it was developed,how it works,and what proteins have been produced.We also describe new promoters and auxotrophic marker/host strain combinations which extend the usefulness of the system.ß2000Federation of European Microbiological Societies.Published by Elsevier Science B.V.All rights reserved.Keywords:Foreign gene expression;Heterologous protein production;Methylotrophic yeast;Pichia pastoris;Alcohol oxidase1gene promoter;Protein secretionContents1.Introduction (46)1.1.Pichia pastoris as an experimental organism (46)1.2.Methanol metabolism (46)1.3.AOX1promoter (46)1.4.Molecular genetic manipulation (47)2.Construction of expression strains (47)2.1.Expression vectors (48)2.2.Alternative promoters (48)2.3.Selectable markers (48)2.4.Host strains (49)2.5.Integration of expression vectors into the P.pastoris genome (50)2.6.Generating multicopy strains (50)2.7.High cell density growth in fermenter cultures (50)3.Post-translational modi¢cation of secreted proteins (52)3.1.Secretion signal selection (52)3.2.O-Linked glycosylation (53)3.3.N-Linked glycosylation (53)4.Conclusions (53)0168-6445/00/$20.00ß2000Federation of European Microbiological Societies.Published by Elsevier Science B.V.All rights reserved.PII:S0168-6445(99)00029-7Acknowledgements .........................................................58References ...............................................................581.Introduction1.1.Pichia pastoris as an experimental organismThirty years ago,Koichi Ogata ¢rst described the ability of certain yeast species to utilize methanol as a sole source of carbon and energy [1].The methylotrophs attracted immediate attention as potential sources of single-cell pro-tein (SCP)to be marketed primarily as high-protein ani-mal feed.During the 1970s,Phillips Petroleum Company developed media and protocols for growing Pichia pastoris on methanol in continuous culture at high cell densities (s 130g l 31dry cell weight,Fig.1)[2].Unfortunately,the oil crisis of the 1970s caused a dramatic increase in the cost of methane.Concomitantly,the price of soybeans,the major alternative source of animal feed,fell.As a result,the economics of SCP production from methanol were never favorable.In the following decade,Phillips Petroleum contracted with the Salk Institute Biotechnology/Industrial Associ-ates,Inc.(SIBIA,La Jolla,CA)to develop P.pastoris as an organism for heterologous protein expression.Re-searchers at SIBIA isolated the gene and promoter for alcohol oxidase,and generated vectors,strains,and corre-sponding protocols for the molecular genetic manipulation of P.pastoris .The combination of the fermentation meth-ods developed for the SCP process and the alcohol oxidase promoter's strong,regulated expression e¡ected surpris-ingly high levels of foreign protein expression.In 1993,Phillips Petroleum sold its P.pastoris expression system patent position to Research Corporation Technologies (Tucson,AZ),the current patent holder.In addition,Phil-lips Petroleum licensed Invitrogen Corporation (Carlsbad,CA)to sell components of the system,an arrangement that continues under Research Corporation Technologies.1.2.Methanol metabolismThe conceptual basis for the P.pastoris expression sys-tem stems from the observation that some of the enzymes required for methanol metabolism are present at substan-tial levels only when cells are grown on methanol [3,4].Biochemical studies showed that methanol utilization re-quires a novel metabolic pathway involving several unique enzymes [3].The enzyme alcohol oxidase (AOX)catalyzes the ¢rst step in the methanol utilization pathway,the ox-idation of methanol to formaldehyde and hydrogen per-oxide (Fig.2).AOX is sequestered within the peroxisome along with catalase,which degrades hydrogen peroxide to oxygen and water.A portion of the formaldehyde gener-ated by AOX leaves the peroxisome and is further oxi-dized to formate and carbon dioxide by two cytoplasmic dehydrogenases,reactions that are a source of energy for cells growing on methanol.The remaining formaldehyde is assimilated to form cel-lular constituents by a cyclic pathway that starts with the condensation of formaldehyde with xylulose 5-monophos-phate,a reaction catalyzed by a third peroxisomal enzyme dihydroxyacetone synthase (DHAS).The products of this reaction,glyceraldehyde 3-phosphate and dihydroxyace-tone,leave the peroxisome and enter a cytoplasmic path-way that regenerates xylulose 5-monophosphate and,for every three cycles,one net molecule of glyceraldehyde 3-phosphate.Two of the methanol pathway enzymes,AOX and DHAS,are present at high levels in cells grown on methanol but are not detectable in cells grown on most other carbon sources (e.g.,glucose,glycerol,or ethanol).In cells fed methanol at growth-limiting rates in fermenter cultures,AOX levels are dramatically induced,constitut-ing s 30%of total soluble protein [5,6].1.3.AOX1promoterThere are two genes that encode alcohol oxidase in P.pastoris :AOX1and AOX2;AOX1is responsible for a vast majority of alcohol oxidase activity in the cell[7^9].Fig.1.High cell density culture of P.pastoris .The centrifuge bottle on the left shows a P.pastoris culture grown in a £ask to a density of 1OD 600unit.The bottle on the right contains a sample of the strain grown in a fermenter to a density of 130g l 31dry cell weight (V 500OD 600units).J.L.Cereghino,J.M.Cregg /FEMS Microbiology Reviews 24(2000)45^6646Expression of the AOX1gene is controlled at the level of transcription [7^9].In methanol-grown cells,V 5%of poly(A) RNA is from AOX1;however,in cells grown on most other carbon sources,AOX1message is undetect-able [10].The regulation of the AOX1gene appears to involve two mechanisms:a repression/derepression mech-anism plus an induction mechanism,similar to the regu-lation of the Saccharomyces cerevisiae GAL1gene.Unlike GAL1regulation,the absence of a repressing carbon source,such as glucose in the medium,does not result in substantial transcription of AOX1.The presence of meth-anol is essential to induce high levels of transcription [7].1.4.Molecular genetic manipulationTechniques required for the molecular genetic manipu-lation of P.pastoris ,such as DNA-mediated transforma-tion,gene targeting,gene replacement,and cloning by functional complementation,are similar to those described for S.cerevisiae .P.pastoris can be transformed by electro-poration,a spheroplast generation method,or whole cell methods such as those involving lithium chloride and polyethylene glycol 1000[11^14].As in S.cerevisiae ,P.pas-toris exhibits a propensity for homologous recombination between genomic and arti¢cially introduced DNAs.Cleav-age of a P.pastoris vector within a sequence shared by the host genome stimulates homologous recombination events that e¤ciently target integration of the vector to that ge-nomic locus [15].Gene replacements occur at lower fre-quencies than those observed in S.cerevisiae and appear to require longer terminal £anking sequences to e¤ciently direct integration [14].P.pastoris is a homothallic ascomycetous yeast that can also be manipulated by classical genetic methods [10,16].Unlike homothallic strains of S.cerevisiae ,which are dip-loid,P.pastoris remains haploid unless forced to mate.Strains with complementary markers can be mated by subjecting them to a nitrogen-limited medium.After 1day on this medium,cells are shifted to a standardminimal medium supplemented with nutrients designed to select for complementing diploid cells (not self-mated or non-mated parental cells).The resulting diploids are stable as long as they are not subjected to nutritional stress.To obtain spore products,diploids are returned to the nitrogen-limited medium,which stimulates them to proceed through meiosis and sporulation.Spore products are handled by random spore techniques rather than micromanipulation,since P.pastoris asci are small and di¤cult to dissect.Yet most standard classical genetic ma-nipulations,including mutant isolation,complementation analysis,backcrossing,strain construction,and spore analysis,can be accomplished.2.Construction of expression strainsExpression of any foreign gene in P.pastoris requires three basic steps:(1)the insertion of the gene into an expression vector;(2)introduction of the expression vec-tor into the P.pastoris genome;and (3)examination of potential expression strains for the foreign gene product.A variety of P.pastoris expression vectors and host strains are available.A generalized diagram of an expression vec-tor and a list of possible vector components are shown in Fig.3and Table 1,respectively.More detailed informa-tion on vectors and strains can be found elsewhere [17,18].In addition,the DNA sequence of many vectors can be found at the Invitrogen website ().Table 2shows a list of commonly used P.pastoris hoststrains.Fig.2.The methanol pathway in P.pastoris .1,alcohol oxidase;2,cata-lase;3,formaldehyde dehydrogenase;4,formate dehydrogenase,5,di-hydroxyacetone synthase;6,dihydroxyacetone kinase;7,fructose 1,6-bi-phosphate aldolase;8,fructose1,6-bisphosphatase.Fig.3.General diagram of a P.pastoris expression vector.YFG,`Your Favorite Gene;'*,sites for cassette ampli¢cation.J.L.Cereghino,J.M.Cregg /FEMS Microbiology Reviews 24(2000)45^66472.1.Expression vectorsAll expression vectors have been designed as Escherichia coli/P.pastoris shuttle vectors,containing an origin of rep-lication for plasmid maintenance in E.coli and markers functional in one or both organisms.Most expression vec-tors have an expression cassette composed of a 0.9-kb fragment from AOX1composed of the 5P promoter se-quences and a second short AOX1-derived fragment with sequences required for transcription termination [19].Be-tween the promoter and terminator sequences is a site or multiple cloning site (MCS)for insertion of the foreign coding sequence.In the native AOX1gene,the alcohol oxidase open reading frame (ORF)is preceded by an un-usually long 5P untranslated region (116nt)[8].Generally,the best expression results are obtained when the ¢rst ATG of the heterologous coding sequence is inserted as close as possible to the position of the AOX1ATG.This position coincides with the ¢rst restriction site in most MCSs.In addition,for secretion of foreign proteins,vec-tors are available where in-frame fusions of foreign pro-teins and the secretion signals of P.pastoris acid phospha-tase (PHO1)or S.cerevisiae K -mating factor (K -MF)can be generated.2.2.Alternative promotersAlthough the AOX1promoter has been successfully used to express numerous foreign genes,there are circum-stances in which this promoter may not be suitable.For example,the use of methanol to induce gene expression may not be appropriate for the production of food prod-ucts since methane,a petroleum-related compound,is one source of methanol.Also,methanol is a potential ¢re haz-ard,especially in quantities needed for large-scale fermen-tations.Therefore,promoters that are not induced by methanol are attractive for expression of certain genes.Alternative promoters to the AOX1promoter are the P.pastoris GAP ,FLD1,PEX8,and YPT1promoters.2.2.1.P GAPBoth northern and reporter activation results indicate that the P.pastoris glyceraldehyde 3-phosphate dehydro-genase (GAP )gene promoter provides strong constitutive expression on glucose at a level comparable to that seen with the AOX1promoter [20].GAP promoter activity lev-els in glycerol-and methanol-grown cells are approxi-mately two-thirds and one-third of the level observed for glucose,respectively.The advantage of using the GAP promoter is that methanol is not required for induction,nor is it necessary to shift cultures from one carbon source to another,making strain growth more straightforward.However,since the GAP promoter is constitutively ex-pressed,it is not a good choice for the production of proteins that are toxic to the yeast.2.2.2.P FLD1The FLD1gene encodes a glutathione-dependent form-aldehyde dehydrogenase,a key enzyme required for the metabolism of certain methylated amines as nitrogen sour-ces and methanol as a carbon source [21].The FLD1pro-moter can be induced with either methanol as a sole car-bon source (and ammonium sulfate as a nitrogen source)or methylamine as a sole nitrogen source (and glucose as a carbon source).After induction with either methanol or methylamine,P FLD1is able to express levels of a L -lacta-mase reporter gene similar to those obtained with metha-nol induction from the AOX1promoter.The FLD1pro-moter o¡ers the £exibility to induce high levels of expression using either methanol or methylamine,an inex-pensive nontoxic nitrogen source.2.2.3.P PEX8,P YPT1For some applications,the AOX1,GAP ,and FLD1promoters may be too strong,expressing genes at too high a level.There is evidence that,for certain foreign genes,the high level of expression from P AOX1may over-whelm the post-translational machinery of the cell,causing a signi¢cant proportion of foreign protein to be misfolded,unprocessed,or mislocalized [22,23].For these and other applications,moderately expressing promoters are desir-able.Toward this end,the P.pastoris PEX8and YPT1promoters may be of use.The PEX8gene encodes a per-oxisomal matrix protein that is essential for peroxisome biogenesis [24].It is expressed at a low but signi¢cant level on glucose and is induced modestly when cells are shifted to methanol.The YPT1gene encodes a GTPase involved in secretion,and its promoter provides a low but constit-utive level of expression in media containing either glu-cose,methanol,or mannitol as carbon sources [25].2.3.Selectable markersAlthough classical and molecular genetic techniques are generally well-developed for P.pastoris ,few selectable marker genes have been described for the molecular genet-ic manipulation of the yeast.Existing markers are limited to the biosynthetic pathway genes HIS4from either P.pastoris or S.cerevisiae ,ARG4from S.cerevisiae ,and the Sh ble gene from Streptoalloteichus hindustanus which confers resistance to the bleomycin-related drug zeocin [11,26,27].The stable expression of human type III colla-gen illustrates the need for multiple selectable markers inTable 1Relevant components of vectors used for protein expression in P.past-orisSecretion signals none,PHO1,K -MF,SUC2,PHA-EMarker genes ADE1,ARG4,G418,HIS4,URA3,Zeo r PromotersAOX1,GAP,FLD1,PEX8,YPT1See text for explanation of di¡erent elements.J.L.Cereghino,J.M.Cregg /FEMS Microbiology Reviews 24(2000)45^6648P.pastoris[28].The production of collagen requires the coexpression of prolyl4-hydroxylase,a central enzyme in the synthesis and assembly of trimeric collagen.Since prol-yl4-hydroxylase is an K2L2tetramer,the L subunit of which is protein disul¢de isomerase(PDI),three markers ^Arg,His,and zeocin resistance^were necessary to co-express all three polypeptides in the same P.pastoris strain.Recently,a new set of biosynthetic markers has been isolated and characterized:the P.pastoris ADE1(PR-ami-doimidazolesuccinocarboxamide synthase),ARG4(argini-nosuccinate lyase),and URA3(orotidine5P-phosphate de-carboxylase)genes[29].Each of these selectable markers has been incorporated into expression vectors.In addition, a series of host strains containing all possible combina-tions of ade1,arg4,his4,and ura3auxotrophies has been generated(Table2).2.4.Host strainsAll P.pastoris expression strains are derived from NRRL-Y11430(Northern Regional Research Laborato-ries,Peoria,IL).Most have one or more auxotrophic mu-tations which allow for selection of expression vectors containing the appropriate selectable marker gene upon transformation.Prior to transformation,all of these strains grow on complex media but require supplementa-tion with the appropriate nutrient(s)for growth on mini-mal media.2.4.1.Methanol utilization phenotypeMost P.pastoris host strains grow on methanol at the wild-type rate(Mut ,methanol utilization plus pheno-type).However,two other types of host strains are avail-able which vary with regard to their ability to utilize meth-anol because of deletions in one or both AOX genes. Strains with AOX mutations are sometimes better pro-ducers of foreign proteins than wild-type strains[30^32]. Additionally,these strains do not require the large amounts of methanol routinely used for large-scale fer-mentations of Mut strains.KM71(his4arg4aox1v:: SARG4)is a strain where AOX1has been partially deleted and replaced with the S.cerevisiae ARG4gene[15].Since the strain must rely on the weaker AOX2for methanol metabolism,it grows slowly on this carbon source (Mut s,methanol utilization slow phenotype).Another strain,MC100-3(his4arg4aox1v::SARG4aox2v:: Phis4),is deleted for both AOX genes and is totally unable to grow on methanol(Mut3,methanol utilization minus phenotype)[9].All of these strains,even the Mut3strain, retain the ability to induce expression at high levels from the AOX1promoter[32].2.4.2.Protease-de¢cient host strainsSeveral protease-de¢cient strains^SMD1163(his4pep4 prb1),SMD1165(his4prb1),and SMD1168(his4pep4)^ have been shown to be e¡ective in reducing degradation of some foreign proteins[23,33].This is especially noticeable in fermenter cultures,because the combination of high cellTable2P.pastoris host strainsStrain Genotype Reference Auxotrophic strainsY-11430wild-type NRRL aGS115his4[11]GS190arg4[16]JC220ade1[16]JC254ura3[16]GS200arg4his4[11]JC227ade1arg4[29]JC304ade1his4[29]JC305ade1ura3[29]JC306arg4ura3[29]JC307his4ura3[29]JC300ade1arg4his4[29]JC301ade1his4ura3[29]JC302ade1arg4ura3[29]JC303arg4his4ura3[29]JC308ade1arg4his4ura3[29] Protease-de¢cient strainsKM71v aox1::SARG4his4arg4[7]MC100-3v aox1::SARG4v aox2::Phis4his4arg4[9]SMD1168v pep4::URA3his4ura3[38]SMD1165prb1his4[38]SMD1163pep4prb1his4[38]SMD1168kex1::SUC2v pep4::URA3v kex1::SUC2his4ura3[34]a Northern Regional Research Laboratories,Peoria,IL.J.L.Cereghino,J.M.Cregg/FEMS Microbiology Reviews24(2000)45^6649density and lysis of a small percentage of cells results in a relatively high concentration of these vacuolar proteases. An additional protease-de¢cient strain SMD1168v pe-p4::URA3v kex1::SUC2his4ura3was recently devel-oped to inhibit proteolysis of murine and human endo-statin.Kex1protease can cleave carboxy-terminal lysines and arginines.Therefore,the deletion strain was generated to inhibit carboxy-terminal proteolysis.After40h of fer-mentation,puri¢cation of intact endostatin was achieved [34].Unfortunately,these protease-de¢cient cells are not as vigorous as wild-type strains with respect to PEP4.In addition to lower viability,they possess a slower growth rate and are more di¤cult to transform.Therefore,the use of protease-de¢cient strains is only recommended in situa-tions where other measures to reduce proteolysis have yielded unsatisfactory results.2.5.Integration of expression vectors into the P.pastorisgenomeExpression vectors are integrated into the P.pastoris genome to maximize the stability of expression strains. This can be done in two ways.The simplest way is to restrict the vector at a unique site in either the marker gene(e.g.,HIS4)or the AOX1promoter fragment and then to transform it into the appropriate auxotrophic mu-tant.The free DNA termini stimulate homologous recom-bination events that result in single crossover-type integra-tion events into these loci at high frequencies(50^80%of His transformants).The remaining transformants have undergone gene conversion events in which only the marker gene from the vector has integrated into the mu-tant host locus without other vector sequences. Alternatively,certain P.pastoris expression vectors can be digested in such a way that the expression cassette and marker gene are released,£anked by5P and3P AOX1 sequences.Approximately10^20%of transformation events are the result of a gene replacement event in which the AOX1gene is deleted and replaced by the expression cassette and marker gene.This disruption of the AOX1 gene forces these strains to rely on the transcriptionally weaker AOX2gene for growth on methanol[31],and,as a result,these strains have a Mut s phenotype.These gene replacement strains are easily identi¢ed among trans-formed colonies by replica-plating them to methanol and selecting those with reduced ability to grow on methanol. As mentioned previously,the potential advantage of Mut s strains is that they utilize less methanol and sometimes express higher levels of foreign protein than wild-type (Mut )strains,especially in shake-£ask cultures[15].2.6.Generating multicopy strainsOptimization of protein expression often,but not al-ways,includes the isolation of multicopy expression strains.A strain that contains multiple integrated copies of an expression cassette can sometimes yield more heter-ologous protein than single-copy strains[22,35].Three approaches lead reliably to multicopy expression strains in P.pastoris.As shown in Fig.4,the¢rst ap-proach involves constructing a vector with multiple head-to-tail copies of an expression cassette[23].The key to generating this construction is a vector which has an expression cassette£anked by restriction sites which have complementary termini(e.g.,Bam HI-Bgl II,Sal I-Xho I combinations).The process of repeated cleavage and reinsertion results in the generation of a series of vectors that contain increasing numbers of expression cas-settes.A particular advantage to this approach,especially in the production of human pharmaceuticals,is that the precise number of expression cassettes is known and can be recovered for direct veri¢cation by DNA sequencing.A second method utilizes expression vectors that con-tain the P.pastoris HIS4and the bacterial Tn903kan r genes.The bacterial kanamycin resistance gene also con-fers resistance to the related eukaryotic antibiotic G418 [36].The level of G418resistance can be roughly corre-lated to vector copy number.P.pastoris must¢rst be transformed to His prototrophy;then multicopy trans-formants are screened by replica-plating to plates contain-ing G418.This method results in a subset of colonies enriched for those containing multiple expression vector copies.However,the vector copy number varies greatly; thus,a signi¢cant number(50^100)of transformants must be subjected to further analysis of copy number and ex-pression level.By this approach,strains carrying up to30 copies of an expression cassette have been isolated[35].A third approach to constructing multicopy strains in-volves the use of a vector with the bacterial Sh ble gene, which confers resistance to the antibiotic zeocin[27].Un-like G418selection,strains transformed with expression cassettes containing the zeocin marker can be selected di-rectly by resistance to the drug.Additionally,populations of transformants can be enriched for multicopy expression cassette strains simply by plating on increased concentra-tions of zeocin in the selection plates.Also,because the Sh ble gene can serve as a selectable marker in both bacteria and yeast,these expression vectors are compact and con-venient to use.However,as with the G418selection,most transformants resistant to high levels of zeocin do not contain multiple vector copies,and numerous transform-ants must be screened for ones that do.2.7.High cell density growth in fermenter culturesP.pastoris is a poor fermenter,a major advantage rel-ative to S.cerevisiae.In high cell density cultures,ethanol (the product of S.cerevisiae fermentation)rapidly builds to toxic levels which limit further growth and foreign protein production.With its preference for respiratory growth,P.pastoris can be cultured at extremely high den-J.L.Cereghino,J.M.Cregg/FEMS Microbiology Reviews24(2000)45^66 50sities (500OD 600U ml 31)in the controlled environment of the fermenter with little risk of `pickling'itself.Fermenta-tion growth is especially important for secreted proteins,as the concentration of product in the medium is roughly proportional to the concentration of cells in culture.An-other positive aspect of growing P.pastoris in fermenter cultures is that the level of transcription initiated from the AOX1promoter can be 3^5times greater in cells fed meth-anol at growth-limiting rates compared to cells grown in excess methanol.Thus,even for intracellularly expressed proteins,product yields are signi¢cantly higher from fer-menter cultured cells.Also,methanol metabolism utilizes oxygen at a high rate,and expression of foreign genes is negatively a¡ected by oxygen limitation.Only in the con-trolled environment of a fermenter is it feasible to monitor and adjust oxygen levels in the culture medium.A hallmark of the P.pastoris system is the ease with which expression strains scale-up from shake-£ask to high-density fermenter cultures.Although some foreign pro-teins have expressed well in shake-£ask cultures,expres-sion levels are typically low compared to fermenter cul-tures.Considerable e¡ort has gone into the optimization of heterologous protein expression techniques,and de-tailed fed-batch and continuous culture protocols are available [23,37^39].In general,strains are grown initially in a de¢ned medium containing glycerol as its carbon source.During this time,biomass accumulates but heter-ologous gene expression is fully repressed.Upon depletion of glycerol,a transition phase is initiated in which addi-tional glycerol is fed to the culture at a growth-limiting rate.Finally,methanol or a mixture of glycerol and meth-anol is fed to the culture to induce expression.Thecon-Fig.4.Scheme for construction of vectors with multiple copies of a foreign gene expression cassette (from [22]).J.L.Cereghino,J.M.Cregg /FEMS Microbiology Reviews 24(2000)45^6651centration of foreign protein is monitored in the culture to determine time of harvest.The growth conditions for P.pastoris are ideal for large-scale production of heterologous protein,because the me-dium components are inexpensive and de¢ned,consisting of pure carbon sources(glycerol and methanol),biotin, salts,trace elements,and water.This medium is free of unde¢ned ingredients that can be sources of pyrogens or toxins and is therefore compatible with the production of human pharmaceuticals.Also,since P.pastoris is cultured in media with a relatively low pH and methanol,it is less likely to become contaminated by most other microorgan-isms.3.Post-translational modi¢cation of secreted proteinsA major advantage of P.pastoris over bacterial expres-sion systems is that the yeast has the potential to perform many of the post-translational modi¢cations typically as-sociated with higher eukaryotes,such as processing of sig-nal sequences(both pre and prepro type),folding,disul¢de bridge formation,certain types of lipid addition,and O-and N-linked glycosylation.3.1.Secretion signal selectionForeign proteins expressed in P.pastoris can be pro-duced either intracellularly or extracellularly.Because this yeast secretes only low levels of endogenous proteins, the secreted heterologous protein constitutes the vast ma-jority of total protein in the medium(Fig.5).Therefore, directing a heterologous protein to the culture medium can serve as a substantial¢rst step in puri¢cation.However, due to protein stability and folding requirements,the op-tion of secretion is usually reserved for foreign proteins that are normally secreted by their native hosts.In many cases,researchers simply need to take advantage of the pre-made expression cassettes available from Invitrogen. Using selected P.pastoris vectors,researchers can clone a foreign gene in frame with sequences encoding either the native signal,the S.cerevisiae K-factor prepro peptide, or the P.pastoris acid phosphatase(PHO1)signal. Although several di¡erent secretion signal sequences, including the native secretion signal present on heterolo-gous proteins,have been used successfully,results have been variable.The S.cerevisiae K-factor prepro peptide has been used with the most success.This signal sequence consists of a19-amino acid signal(pre)sequence followed by a66-residue(pro)sequence containing three consensus N-linked glycosylation sites and a dibasic Kex2endopep-tidase processing site[40].The processing of this signal sequence involves three steps.The¢rst is the removal of the pre signal by signal peptidase in the endoplasmic retic-ulum.Second,Kex2endopeptidase cleaves between Arg-Lys of the pro leader sequence.This is rapidly followed by cleavage of Glu-Ala repeats by the Ste13protein[41].The e¤ciency of this process can be a¡ected by the surround-ing amino acid sequence.For instance,the cleavage e¤-ciencies of both Kex2and Ste13proteins can be in£uenced by the close proximity of proline residues.In addition,the tertiary structure formed by a foreign protein may protect cleavage sites from their respective proteases.The S.cerevisiae K-MF prepro signal sequence is the classical and most widely used secretion signal(see Table 3,expressed proteins).In some cases,it is a better secre-tion signal for expression in P.pastoris than the leader sequence of the native heterologous protein.In a study concerning the expression of the industrial lipase Lip1 from Candida rugosa,the e¡ect of heterologous leader sequences on expression and secretion was investigated [42].It was found that the native Lip1p leader sequence allowed for secretion but somehow hampered expression. Either the K-factor pre or prepro signal was adequate for both secretion and expression,but the highest level of lipase secretion was from a clone with the full prepro sequence.This clone produced two species of secreted pro-tein.A small percentage was correctly processed to the mature protein.However,a majority of the product con-tained four additional N-terminal amino acids.Variability in the amino terminus is commonly seen with heterologous proteins secreted by P.pastoris using the K-factor prepro leader.In some cases,the standard K-MF or PHO1secretion signals have not worked,so synthetic leaders have been created.Martinez-Ruiz et al.[43]made mutations in the native leader to reconstruct a more e¤cient Kex2p recog-nition motif(Lys-Arg).This aided in secretion of the ri-bosome-inactivation protein K-sarcin from the mold As-pergillus giganteus.Another more drastic solution was to create an entirely synthetic prepro leader.For the expres-sion of human insulin,a synthetic leader and spacer se-quence was found to improve secretion and protein yield[44].Fig.5.Secreted expression of human serum albumin.7.5%SDS-PAGE of25-W l sample of culture supernatant from a P.pastoris strain(GS-HSA#4141)expressing human serum albumin.Cells were induced in BMMY(bu¡ered methanol-complex medium)for0,12,24,48,and ne M contains molecular mass markers(kDa).J.L.Cereghino,J.M.Cregg/FEMS Microbiology Reviews24(2000)45^66 52。
毕赤酵母高效表达策略-1
1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。
由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。
尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。
A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。
因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。
巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。
（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。
外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。
2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。
PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。
通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。
（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。
（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。
毕赤酵母的密码子用法分析
关键词 毕赤酵母, 密码子用法, 优越密码子 中图分类号 Q755, Q 9391 5 文献标识码 A
文章编号 1000- 3061( 2000) 03- 0308- 04
酵母表达系统是基因工程研究中最常用的表达 系统之一。近年来, 除酿酒酵母外, 还发展了 Pichia p astor is , K luy veromy ces l actis , Yar row i a l ip olyt ica 等非常规酵 母表达 系统, 其 中尤以 Pichia p astoris 用得最广[ 1] 。
生物工程学报 Chinese Jour nal of Biotechnology
V ol. 16 No. 3 M ay 2000
毕赤酵母的密码子用法分析
赵 翔 霍克克* 李育阳
( 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室 上海 200433)
摘 要 通过分析 Pichia p astoris 的 28 个蛋白编码基因 的同义密码子使用情况并计算该酵母的 密码子用法, 首次 确定出 P . p astor is 的 19 个高表达优越密码子。这些结果经与已知的 Sacchar omyces cerevisiae 及K luy ver omy ces lactis 的密码子用法基本相似, 但在氨基酸谷氨酸的密码子选择 上截然相 反, 提 示这可 能属于 P . p astor is 所偏 爱的密 码子用法。
毕赤酵母表达系统原理
毕赤酵母表达系统原理《毕赤酵母表达系统那点事儿》嘿，朋友们！今天咱来唠唠毕赤酵母表达系统。
这玩意儿可有意思啦！你看啊，毕赤酵母就像是一个神奇的小工厂。
它呀，能把我们想要的东西给生产出来。
想象一下，它就像一个勤劳的小工匠，在自己的小天地里忙忙碌碌。
这个小工厂有自己的一套工作流程呢。
首先，我们得把我们需要表达的基因送进去，就好像给小工匠下达一个任务订单。
毕赤酵母接收到这个基因后，就开始开动啦。
它会利用自己身体里的各种零部件和原材料，一点一点地把这个基因表达出来，变成我们想要的蛋白质。
它可厉害了，能生产出各种各样的蛋白质。
就像一个万能的大厨，不管你要做什么菜，它都能给你做出来。
而且啊，它做出来的东西质量还挺高。
毕赤酵母还有个优点，就是它比较好养活。
不需要特别复杂的条件，给它点吃的喝的，它就能茁壮成长。
这就像咱家里养的小宠物，只要你稍微照顾一下它，它就能给你带来很多欢乐。
不过呢，毕赤酵母也不是完美的啦。
有时候它也会出点小差错，就像人一样，偶尔也会犯点小迷糊。
但这并不影响它的可爱和实用呀。
在实际应用中，毕赤酵母表达系统可是帮了大忙呢。
比如说在生物医药领域，很多药物的生产都离不开它。
它就像一个幕后英雄，默默地为我们的健康贡献着力量。
我记得有一次，我在实验室里研究一个项目，就是用毕赤酵母表达系统来生产一种蛋白质。
那时候真是费了不少心思，不断地调整各种条件，就盼着能得到高质量的产物。
经过一番努力，终于看到了成果，那一刻的心情真是无法用言语来形容。
总之呢，毕赤酵母表达系统是个很有趣也很有用的东西。
它虽然小小的，但却有着大大的能量。
它就像一颗闪亮的星星，在科学的天空中绽放着自己的光芒。
我们要好好利用它，让它为我们创造更多的价值呀！。
毕赤酵母表达知识
毕赤酵母表达知识很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
毕赤酵母内源蛋白表达系统 发酵优化策略
毕赤酵母内源蛋白表达系统发酵优化策略随着生物技术和生物医药行业的快速发展，蛋白表达成为了研究和生产领域中一个至关重要的环节。
毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种有效的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白表达、酶制备等领域。
本文将从毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略进行探讨，以期为相关研究提供一定的参考和借鉴意义。
一、毕赤酵母内源蛋白表达系统简介毕赤酵母是一种酿酒酵母，具有真核生物和原核生物的特点，具有许多原核和真核表达系统的优点。
Pichia pastoris作为一种高效的真菌表达系统，广泛应用于蛋白质表达、酶制备、重组激素和疫苗生产、抗体工程等领域。
毕赤酵母在高密度、大规模表达的过程中具有许多优点，例如可以利用化石燃料产生的甲醇为碳源并利用氧化酶将甲醇作为能源，这使得它在蛋白质大规模表达中的应用有了很大的便利；其次methylotrophic yeast P.pastoris是一种易于操作的槽稠传播。
分泌蛋白在生成后由细胞外酶直接切割。
得到的目的蛋白质易纯化和分离。
由于其许多优点，毕赤酵母内源蛋白表达系统在生物技术和制药行业中受到极大的关注。
二、毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略（一）基础培养基的选择在毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵过程中，培养基的选择对于蛋白质的表达和纯化至关重要。
通常情况下，毕赤酵母内源蛋白表达系统常用的基础培养基包括YPG液体培养基、BMGY培养基和BMMY培养基。
其中，BMGY培养基在毕赤酵母的扩大培养和生长过程中被广泛应用，其主要成份包括酵母抽提物（yeast extract）、复合酵母粉（peptone）、甘油（glycerol）和缓冲盐溶液等。
而BMMY培养基主要用于毕赤酵母内源蛋白表达系统的诱导表达过程，其主要成份包括酵母醣（yeast extract）、蛋白胨（peptone）、抗泡剂（anti-foaming agent）以及甲醇（methanol）等。
毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用2_占今舜
3.2 pH 值
毕 赤 酵 母 能 在 pH3.0 ～ 7.0 的 范 围内生长。在不同的表达体系中，不同 的蛋白酶需要最佳 pH 值存在不同，且 不同的重组蛋白对蛋白酶的耐受性有差 异，因此选择适当的发酵 pH 值不仅不 影响细胞的生长，还能降低蛋白酶活性 甚至灭活，减少目的蛋白的降解。Xue 等 [20] 研究发现，pH 值在 5.8 ～ 8.0 的 范围内，真菌免疫调节蛋白 LZ-8 蛋白 表达量随 pH 值上升而提高，且 pH 值 到 8.0 时， 蛋白表达量达到峰值。另外， Zhao 等 [21] 研究结果表明，即使对于同 一工程菌，它的菌种生长阶段和表达阶 段的最适 pH 值也不一样。
4 小结
自上个世纪的 60 年代，人们发现 可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长的 酵母以来，它们不仅因能够生产单细胞 蛋白作为动物饲料的潜力而引起了广泛 关注，还可以通过其克隆表达外源蛋白 而被广泛利用。如今，毕赤酵母由于在 基因克隆和表达中具有明显的优点而被 广泛应用于医药领域和动植物生产。但 是其也存在一些不足，如发酵周期较 长 ；甲 醇 具 有 易 燃 易 爆 以 及 有 毒 性， 在生产中存在危险性 ；培养基和培养 条件不太成熟等。但是，随着人们对 其不断的研究和优化条件，减少其存在 的不足，提高其生产效率，将更加广泛 地应用于生产。
[3] D E M A I N A L , V A I S H N A V P ． Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms[J].Biotechnology Advance,2009,27(3):297-306． [4] P F E F F E R J , R I C H T E R S , NIEVELER J, et al．High yield expression of lipase A from Candida antarctica in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and its purification and characterisation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72(5) : 931-938． [5] ZHANG A L, ZHANG T Y, LUO J X, et al．Inducible expression of human angiostatin by AOXI promoter in P．pastoris using high-density cell culture[J].Molecular Biology Reports,2009,36(8):2265-2270． [6] JIN F L, XU X X, YU X Q, et al．Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Process Biochemistry, 2009,44: 11-16． [7] H A R T N E R F S , G L I E D E R A ． Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts[J]. Microbial Cell Factories,2006,5:39． [8] YU P．A new approach to the production of the recombinant SOD protein by methylotrophic Pichia pastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(1):93-98． [9] G H A F F A R A , K H A N S A , MUKHTAR Z, et al．Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115[J]. Molecular Biology Reports,2011,38（5）:3227-3233. [10] 吕中原，钱江潮， 储炬，等 . 同时利用 AOX1 和 GAP 启动子表达 SAM 合成酶 促进重组毕赤酵母中 S- 腺苷甲硫氨酸 积 累 [J]. 工 业 微 生 物，2008，38（4） ： 24-30. [11] LIN-CEREGHINO J, HASHIMOTO M D, MOY A, et al. Direct selection of Pichia pastoris expression strains using new G418 resistan cevectors[J]. Yeast, 2008, 25 (4) : 293- 299. [12] YANG L,AN X,WEI F,et al． E x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f recombinant human interleukin-18 protein using a yeast expression system[J].Protein Expression and
毕赤酵母表达系统使用心得
毕赤酵母表达系统使用心得PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中XiangYang是来自美国乔治城大学GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。
4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。
5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。
Pichia酵母表达系统使用心得资料
Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。
生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。
毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
裂解酶 毕赤酵母表达
裂解酶毕赤酵母表达裂解酶是一种重要的酶类，能够将高分子物质裂解为较小的分子，被广泛应用于制药、食品、化工等领域。
毕赤酵母是一种常见的酵母菌，因其生长速度快，易培养，被广泛应用于分子生物学研究领域。
本文将围绕着“裂解酶毕赤酵母表达”这一主题，进行详细阐述。
第一步，克隆裂解酶基因首先需要克隆裂解酶基因。
裂解酶基因可以从天然菌株或基因库中获得。
一般情况下，可采用PCR技术或构建文库的方法进行克隆。
PCR克隆是一种常见的将特定基因扩增的方法，需要设计引物。
而文库构建则需要将大量的DNA片段克隆到载体上，获取含有目标基因的克隆体。
第二步，构建表达载体获取裂解酶基因后，需要将其插入到表达载体中，以实现外源基因的表达。
表达载体一般包括启动子、编码区、终止序列等部分。
还需要添加适合裂解酶表达的表达基因启动子和信使RNA聚合酶结合位点。
可采用限制性内切酶、LiGA等方法，将裂解酶基因插入到表达载体中。
第三步，转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化到毕赤酵母细胞中。
目前主要有两种转化方法，一种是化学转化，一种是电转化。
化学转化依赖于离子间的相互作用力，可将DNA引入到细胞中。
而电转化则是利用高电压作用于细胞，使其渗透性提高，DNA片段能够进入细胞。
第四步，筛选表达菌株进行转化后，将细胞涂布于含有蔗糖的SD-UF板上进行筛选。
含有蔗糖的培养基只能被表达裂解酶的菌株使用，其他菌株无法生长，通过这种方法可以筛选出表达裂解酶的毕赤酵母菌株。
第五步，表达和纯化裂解酶最后，使用相应的表达条件和纯化方法，纯化表达的裂解酶。
一般情况下，裂解酶是一种外分泌酶，可采用诱导性表达，通过添加诱导因子（如甘露醇）来促进裂解酶的分泌。
常见的纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
总之，裂解酶毕赤酵母表达是一个复杂的过程，需要准确的基因克隆、合适的表达载体、科学的转化方法、合适的筛选条件和纯化方法等。
只有在这些步骤都正确执行的情况下，才能够得到表达裂解酶的毕赤酵母菌株，并最终纯化出高质量的裂解酶。
毕赤酵母表达知识
很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
酵母表达系统使用心得
酵母表达系统使用心得第一篇：酵母表达系统使用心得Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia 酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲醇酵母部分优点：1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达；2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平；3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产；4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。
产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究
３ Ｘ１ ＇ ＡＯ 终止序列，筛选标记等等【 。 】 ３ 巴斯德毕赤酵母的表达蛋白质的塘基化
该 表 达 系 统 不 存 在 原 核 表 达 系 统 的 内毒 素 难 以去 除
的 问题 ，也不存 在哺乳动 物细胞表达 系统 的病 毒和支原
【２杨 维仁，姜 淑贞，杨在 宾等 ． 胃投饲 不 同形 式蛋 氨酸对 肉牛 营养 ｌ】 瘤
山东
２ １ 第 ３ ０ ０年 ｌ
浅 析 巴斯 德 毕 赤酵 母 表 达 系统 的研 究
王 艳 （ 山东省枣庄市畜牧兽 医 局
中 图分 类 号 ：Ｔ ９ ０１ Ｑ ２． 文 献 标 识 码 ：Ｃ
２ ７０ ） ７８０
文 章 编 号 ： １０ —７ ３２ １ ）００ ８ ．２ ０ ７１３ （０ ０１．０ ６０
物质 消化 率和血 液指标 的影 响明 ．畜牧兽 医学报，０４ ３（） １０１６ ２ ０， ５２：６ ．６ ． ０３ 】Ｗｈｔ Ｃ Ｌ Ｔｂ Ｄ ｖ，ｅ ａ Ｉｃｅｓ ｆｃ ｎｙ ｏ ｏ ｉ ， ａｅＬ Ｍ， ｏ ｅ ｔ １ ｎｒａｅｅ ｉ ｃ ｆｗｏｌ ｅ ． ｉ ｅ
ｇ ｏ ｔ ｎ ｉ ｅ ｗ ｅｇ ｔ ｇ ｉ ｎ ｍ ｅ ｉ ｏ ｓ ｅ ｐ ｆｄ ｆ ｎ ｇ ｎ ｃ ｌｐ ｅ ｄ ｒ ｗ ｈ ａ ｄ ｌ ｉ ｈ ａｎ ｉ ｒｎ ｈ ｅ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ ｕ ｉ ｓ ｅ ｖ ｎ
泌 性 的 外 源 蛋 白 占所 有 被 分 泌 蛋 白 的３ ％ 以上 ， 容 易 分 Ｏ
１ 巴斯德毕赤酵￣（ｉ ｉＰ ｓ ｒ） ： ｃ ａ ａｔ ｉ表达系统的特点 Ｐ ｈ ｏｓ
巴斯 德毕赤酵母是近年来 兴起 的一个真核 高效 表达
系 统 ， 具 有 许 多 独特 的优 点 ， 已迅 速 发 展 成 为 分 子 生 物
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法
一、概述毕赤酵母是一种常见的真菌，它在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
在这些领域，研究人员经常需要对蛋白质进行糖基化修饰的研究，而毕赤酵母表达系统正是其中的一种重要工具。
本文将就毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法进行介绍。
二、毕赤酵母表达系统简介1. 毕赤酵母表达系统的原理毕赤酵母表达系统是指利用毕赤酵母表达载体，将目标蛋白基因导入毕赤酵母中，使其在毕赤酵母中进行表达。
该系统具有高度的复制和表达效率，能够在较短的时间内高效地产生目标蛋白。
2. 毕赤酵母表达系统的优势和应用毕赤酵母表达系统具有许多优势，例如能够进行大规模的表达，提高了蛋白质的产量；同时也能够实现正常的翻译后修饰以及蛋白折叠功能。
在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用，如药物开发、生物能源等领域。
三、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法1. 利用质粒表达毕赤酵母表达载体中含有丰富的糖基化因子，对于糖基化位点的研究提供了便利。
研究人员可以将目标蛋白基因克隆至毕赤酵母表达载体中，通过大规模的表达筛选，筛选出糖基化位点进行研究。
2. 利用质粒诱导表达研究人员还可以通过对毕赤酵母进行质粒诱导，使其表达特定的糖基化酶，从而实现对特定蛋白质的糖基化位点的研究。
这种方法能够有效地降低研究成本，是当前常用的研究手段之一。
3. 基因敲除或过表达最近，基因敲除或过表达技术在毕赤酵母的研究中得到了广泛的应用。
研究人员可以通过敲除特定的糖基化酶基因或过表达其基因，从而实现对糖基化位点的研究。
这种方法能够帮助研究人员更深入地了解糖基化位点在蛋白质功能中的作用。
四、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点研究的意义1. 为蛋白质功能研究提供重要依据研究糖基化位点能够帮助人们更深入地了解蛋白质的结构和功能。
糖基化位点通常与蛋白质的功能密切相关，通过研究糖基化位点，可以为蛋白质功能的研究提供重要的依据。
2. 为药物研发提供理论支持糖基化位点在药物研发中也有着重要的意义。
许多药物的研发过程中需要考虑蛋白质的糖基化修饰，因此对糖基化位点进行研究能够为药物研发提供理论支持。
巴斯德毕赤酵母表达系统
毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点
1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达 2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株 3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达
结构特点
一、单细胞微生物
1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、 折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降
解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H 0 对细胞的毒害。
巴斯德毕赤酵母表达系统
报告人：彭平平
起源及背景
• 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。 • 30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源. • 70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。
外源蛋白的引入表达
菌株类型
Mut表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型 存在 存在 正表型 缓慢型
Mut+ 存在 Muts 缺失
Mut- 缺失
缺失
负型
选择过程
HIS4缺陷培养基 G418酵母培养基导入质粒低 Nhomakorabea高
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。
第一步——构建载体Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。
红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。
leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。
大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。
基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。
这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是：①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；⑦克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；⑧测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。
除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。
第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。
Xiang Yang：EasySelect试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115和KM71H。
我倾向于选择X33，因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator），可以尝试一下。
如果没有的话，EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyComp Transformation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。
leslie：在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了，试剂盒携带有的是X-33，GS115和KM71H这三种毕赤酵母（另外常用的还有SMD1168），每种酵母的特点有些不尽相同（Manual上写的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。
而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用，如在人血清白蛋白(HSA)(为分泌型蛋白)的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。
所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。
另外有个保存问题，原始酵母菌一定要保存好，因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。
在准备酵母菌的同时也需要准备质粒，由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），因此许多时候都会用PEG大提质粒，或者用大提试剂盒，总而言之要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。
在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。
线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。
在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活，说明书建议是热失活或者EDTA，个人认为前者比较好，主要是担心EDTA对于转化的影响，另外这三种酶失活的温度都是65℃/20min。
沉淀回收之后是离心10分钟，用80%的酒精洗涤后风干，这一步需要多加注意保证风干完全，因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。
接下来就是酵母转化了，这是令许多人头疼的一步，也是影响实验决定表达的关键步骤。
转化方法有不少，例如电转，化学转化，原生质体转化，其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的，也就是说电转最容易，转化率较高（但要求有电转仪），而原生质体最麻烦，而且效果不好（比较传统），因此不建议使用，EasySelect说明书上这么建议，并且也详细说明了电转，化学转化（EasyComp和LiCl）方法的过程，可以按部就班。
需要注意的是：（电转过程）①最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；②扩大培养的浓度一定要控制好，个人认为不需要OD600达到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，这个时候的酵母比较新鲜，转化率比较高；③整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；④电转仪需要预热，所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快，曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级，虽然不一定可信，但是我个人也认为这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如〈4）就可能说明杂质较多，会影响转化率；⑤转化后温育是个增加同源重组，增加存活率的过程，需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板（不同浓度抗生素），或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。
（化学转化）如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。