第2章 发酵工业菌种
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http://image.baidu.com/i?ct=503316480&z=0&tn=baiduimagedetail&word=%B2%AE%BD%DC%CA%CF&in=26786&cl=2&lm=-1&pn=8&rn=1&di=5704499700&ln=1&fr=&ic=0&s=0&se=1&sme=0&tab=&width=&height=&face=0&listnum=344#pn6
Collection for Microorganisms, CCCCM), http://micronet.im.ac.cn/database/aboutccccmc.html ）
②中国科学院典型培养物保藏委员会 ③中国典型培养物保藏中心 ④中国工业微生物菌种保藏管理中心 http://www.china-cicc.org/ ⑤美国典型培养物保藏中心（ATCC）http://www.atcc.org/ ⑥英国国家典型培养物保藏中心 ⑦法国巴斯德研究所菌种保藏中心 ⑧德国科赫研究所菌种保藏中心 《细菌学期刊（Journal of Bacteriology）》是国际公认的微 生物分类学方面的权威期刊，所有新鉴定的微生物菌种必 须在此期刊发表才能被认可。
–霉菌 mould (根霉、毛酶、曲霉等)
未培养微生物（Uncultured microorganisms）
迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未 获得纯培养的微生物。约占自然环境微生物群落的99%。 （1）模拟自然培养法；（2）宏基因组分析法
巨大的应用潜力！
主要应用于基因工程菌种方面
http://www.nature.com/ja/journal/v63/n8/images/ja201087f7.jpg
www.bbioo.com/Soft/2007/855.htm
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.5 菌种初筛和复筛
初筛
（1）平板筛选
抑菌圈
http://file.qlteacher.com/upload/cz2010/images/1008/02/101921066.jpg
产乳酸菌 的透明圈
http://www.hl99cn.com/uploadimg/201053119647629.jpg
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
获得适合工业发酵所需菌种的途径：
①从菌种保存机构直接购买
中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） 美国典型菌种保藏中心（ATCC） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 日本大阪发酵研究所（IFO）
…
②从自然界分离筛选 ③从生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分离 筛选
Teh et al. BIOMICROFLUIDICS 5, 044113 (2011)
Agresti et al. PNAS, 2010, 107(9):4004-4009
Ultra-high-throughput screening
Guo et al. Lab Chip, 2012, 12, 2146–2155
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.2 现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定
（1）DNA的碱基组成
DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征，不受菌龄 以及突变因素以外的外界因素的影响，即使个别基因突变， 也不会有明显变化。 用（G+C） 占全部碱基的质量分数（G+C）%来表示
（2）核酸的分子杂交 （3）遗传重组特性分析
2.2.5 菌种初筛和复筛
复筛
在初筛的基础上进一步鉴定菌株生产能力，一般采用 摇瓶培养，一个菌株重复3~5瓶。 需采用精确的分析方法测定（定性和定量）。
样品重复平均值
定量定性分析，如HPLC，GC，MS，NMR…
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.5 菌种初筛和复筛
菌种分离新进展——新设备，新方法
• 连续培养
利用比生长速率进行富集 Monod方程
maxS
百度文库Ks S
比 生 长 速 率
μ S0
基质浓度S
Chemostat 恒化培养器
www.answers.com/topic/chemostat
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.4 菌种分离 （1）平板划线分离法
分离得到单个细胞长成的菌落 简单、较快
（3）血清学试验与噬菌体分型
不同细菌和病毒带有不同的蛋白质、脂蛋白、脂多糖等抗原性物质， 可在生物体外进行不同微生物之间抗原和抗体反应实验——血清学试验来进行 微生物的分类和鉴定。
（4）氨基酸顺序和蛋白质分析
通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的 关系，序列相似性越高，其亲缘关系越近。
2.3.2 现代分类鉴定方法
细胞化学成分特征分类法
常用于细菌分类的细胞成分 ①细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析 ②全细胞水解液的糖型 ③脂肪酸组成及磷脂成分分析 ④醌类及多胺类的分析 ⑤可溶性蛋白的质谱分析
数值分类法（统计分类法）
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定
①中国微生物菌种保藏管理委员会（China Committee of Culture
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.1 经典的分类鉴定方法
（1）形态学特征
反应等。 菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色
（2）生理生化特征
营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需 要、需氧性；对温度、pH、渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代 谢产物及其与宿主的关系等。
（2）控制培养条件
控制溶解氧浓度分离好氧或厌氧菌；高温培养分离嗜热菌；控制 pH分离嗜酸或嗜碱菌；高糖或高盐培养基以分离耐高渗菌种；抗生素 以筛选具有相应抗性的菌株。
• 分批培养
所选条件对目的菌较适宜。目的菌的生长可能改变培养基的性质， 使其他菌也能生长，可转移至新培养基中重建选择压力，进行多次 富集培养。
发酵工程
第2章 发酵工业菌种
北京科技大学 化学与生物工程学院 生物科学与工程系
2.1 发酵工业菌种概述
常用的四大类可培养微生物
–细菌 bacteria (枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等)
–放线菌 actinomycetes (链霉菌、小单孢菌、诺卡菌等) –酵母菌 yeast (啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等)
将复杂而费时的化学测定转变为平皿上肉眼可见的显色 反应，能大幅提高筛选效率，减少工作量。
（2）摇瓶发酵筛选
摇瓶培养更接近发酵罐培养条件，因此筛选出的菌株易 于扩大培养。
Graphs from web
Shaking flask
Culture tube
Micro well culture plate
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.2 现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定
（4）rRNA序列分析
通过比较原核生物16SrRNA和真核生物的18SrRNA的 基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘 出生物进化树。
sequencing
16SrRNA amplification by PCR
2.3 发酵工业菌种鉴定
④基因工程方法构建
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.1 样品的采集 产物是什么？ →培养底物条件、产物特性…
什么类别的菌？→生长环境、耐受性、营养条件…
海底黑烟囱
1、样品的来源：以采集土壤为主。一般耕地、菜园和近郊 土壤中有机质丰富，土壤通气保水性好，以细菌和放线菌 为主；山坡上的森林土壤含有大量腐烂的植物枝叶，有机 质丰富，阴暗潮湿，酵母和霉菌较多。 5~25cm 土层的微 生物数量最多。 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
（a）扇形划线法
（b）连续划线法
（c）方格划线法
（d）平行划线法
（2）稀释分离法
单菌落分布均匀，获得纯种概率大，特别适合分离具 有蔓延性的微生物。
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
无菌水
固体培养各种微生物形成的菌落特征
http://ns2.auts.edu.cn/jwc/jpkc/shengji/2007/tangbinweishengwuxue/webpage/epage1.html
droplets
Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening
Brouzesa et al. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0903542106
Edwards et al. Analyst, 2013, 138, 339–345
菌落自动挑取、培养、检测
http://www.icr.ac.uk/ncri/coreresources/cancer_gene_cloning.html
http://www.genetix.com/f/core/frontend/http/http.php?dl=63754-image-1&inline=1
（2）化学方法
添加某些化学成分以增加特定微生物的数量。 如：添加几丁质的培养基用来分离放线菌；添加碳酸钙稳定培养基 的pH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质，如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行平板分离。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening
Mutagenesis
For further cultivation and screening Mutant library
Specially designed chip
（3）简单平板分离法 （4）涂布分离法 （5）毛细管分离法 （6）小滴分离法
（7）流式细胞仪
http://www.biomart.cn/50c35b041b9ab7bc011b9ab85433015f/info/1/all/index.htm
流式细胞仪就是进行流式细胞分析的 仪器，它集电子技术、计算机技术、 激光技术、流体理论于一体，是一种 非常先进的检测仪器。 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和 分布情况 分选感兴趣的细胞
Images and picks up to 30000 microbial colonies per day
This robot is used to pick colonies from agar plates into 96 or 384 well culture plates.
http://www.genetix.com/en/systems/qpix_systems/introduction/index.html
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约 10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料 袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等， 以备查考。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.2 样品的预处理 （1）物理方法
热处理、膜过滤法和离心法 热处理减少细菌数，以分离耐热的放线菌繁殖体、孢子和菌丝片段。 膜过滤法和离心法用于浓缩水中微生物细胞。
2.2.3 富集培养
为提高分离效率，可以根据微生物的生长繁殖对环境和营养要求 （温度、pH、渗透压、碳源和氮源类型及浓度等）的不同，使目的微 生物在最适条件下迅速生长繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势 菌种。
（1）控制培养基的营养成分
可加入相应底物作为唯一碳源或氮源 能在同一富集培养基上长的菌并非单一菌种，而是营养类型相同的 微生物群体，需进一步分离。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
发酵工业对菌种的要求：
①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的 产物量高、易于回收； ②生长较快，发酵周期短； ③培养条件易于控制； ④抗噬菌体及杂菌污染的能力强； ⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量 的稳定； ⑥对放大设备的适应性强； ⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物 质和毒素。
2.4 发酵工业菌种改良
菌种选育改良的具体目标
①提高目标产物的产量
生产效率和效益！
②提高目标产物的纯度，减少副产物
可有效降低产物分离成本。
Collection for Microorganisms, CCCCM), http://micronet.im.ac.cn/database/aboutccccmc.html ）
②中国科学院典型培养物保藏委员会 ③中国典型培养物保藏中心 ④中国工业微生物菌种保藏管理中心 http://www.china-cicc.org/ ⑤美国典型培养物保藏中心（ATCC）http://www.atcc.org/ ⑥英国国家典型培养物保藏中心 ⑦法国巴斯德研究所菌种保藏中心 ⑧德国科赫研究所菌种保藏中心 《细菌学期刊（Journal of Bacteriology）》是国际公认的微 生物分类学方面的权威期刊，所有新鉴定的微生物菌种必 须在此期刊发表才能被认可。
–霉菌 mould (根霉、毛酶、曲霉等)
未培养微生物（Uncultured microorganisms）
迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未 获得纯培养的微生物。约占自然环境微生物群落的99%。 （1）模拟自然培养法；（2）宏基因组分析法
巨大的应用潜力！
主要应用于基因工程菌种方面
http://www.nature.com/ja/journal/v63/n8/images/ja201087f7.jpg
www.bbioo.com/Soft/2007/855.htm
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.5 菌种初筛和复筛
初筛
（1）平板筛选
抑菌圈
http://file.qlteacher.com/upload/cz2010/images/1008/02/101921066.jpg
产乳酸菌 的透明圈
http://www.hl99cn.com/uploadimg/201053119647629.jpg
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
获得适合工业发酵所需菌种的途径：
①从菌种保存机构直接购买
中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） 美国典型菌种保藏中心（ATCC） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 日本大阪发酵研究所（IFO）
…
②从自然界分离筛选 ③从生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分离 筛选
Teh et al. BIOMICROFLUIDICS 5, 044113 (2011)
Agresti et al. PNAS, 2010, 107(9):4004-4009
Ultra-high-throughput screening
Guo et al. Lab Chip, 2012, 12, 2146–2155
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.2 现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定
（1）DNA的碱基组成
DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征，不受菌龄 以及突变因素以外的外界因素的影响，即使个别基因突变， 也不会有明显变化。 用（G+C） 占全部碱基的质量分数（G+C）%来表示
（2）核酸的分子杂交 （3）遗传重组特性分析
2.2.5 菌种初筛和复筛
复筛
在初筛的基础上进一步鉴定菌株生产能力，一般采用 摇瓶培养，一个菌株重复3~5瓶。 需采用精确的分析方法测定（定性和定量）。
样品重复平均值
定量定性分析，如HPLC，GC，MS，NMR…
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.5 菌种初筛和复筛
菌种分离新进展——新设备，新方法
• 连续培养
利用比生长速率进行富集 Monod方程
maxS
百度文库Ks S
比 生 长 速 率
μ S0
基质浓度S
Chemostat 恒化培养器
www.answers.com/topic/chemostat
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.4 菌种分离 （1）平板划线分离法
分离得到单个细胞长成的菌落 简单、较快
（3）血清学试验与噬菌体分型
不同细菌和病毒带有不同的蛋白质、脂蛋白、脂多糖等抗原性物质， 可在生物体外进行不同微生物之间抗原和抗体反应实验——血清学试验来进行 微生物的分类和鉴定。
（4）氨基酸顺序和蛋白质分析
通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的 关系，序列相似性越高，其亲缘关系越近。
2.3.2 现代分类鉴定方法
细胞化学成分特征分类法
常用于细菌分类的细胞成分 ①细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析 ②全细胞水解液的糖型 ③脂肪酸组成及磷脂成分分析 ④醌类及多胺类的分析 ⑤可溶性蛋白的质谱分析
数值分类法（统计分类法）
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定
①中国微生物菌种保藏管理委员会（China Committee of Culture
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.1 经典的分类鉴定方法
（1）形态学特征
反应等。 菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色
（2）生理生化特征
营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需 要、需氧性；对温度、pH、渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代 谢产物及其与宿主的关系等。
（2）控制培养条件
控制溶解氧浓度分离好氧或厌氧菌；高温培养分离嗜热菌；控制 pH分离嗜酸或嗜碱菌；高糖或高盐培养基以分离耐高渗菌种；抗生素 以筛选具有相应抗性的菌株。
• 分批培养
所选条件对目的菌较适宜。目的菌的生长可能改变培养基的性质， 使其他菌也能生长，可转移至新培养基中重建选择压力，进行多次 富集培养。
发酵工程
第2章 发酵工业菌种
北京科技大学 化学与生物工程学院 生物科学与工程系
2.1 发酵工业菌种概述
常用的四大类可培养微生物
–细菌 bacteria (枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等)
–放线菌 actinomycetes (链霉菌、小单孢菌、诺卡菌等) –酵母菌 yeast (啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等)
将复杂而费时的化学测定转变为平皿上肉眼可见的显色 反应，能大幅提高筛选效率，减少工作量。
（2）摇瓶发酵筛选
摇瓶培养更接近发酵罐培养条件，因此筛选出的菌株易 于扩大培养。
Graphs from web
Shaking flask
Culture tube
Micro well culture plate
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.3 发酵工业菌种鉴定
2.3.2 现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定
（4）rRNA序列分析
通过比较原核生物16SrRNA和真核生物的18SrRNA的 基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘 出生物进化树。
sequencing
16SrRNA amplification by PCR
2.3 发酵工业菌种鉴定
④基因工程方法构建
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.1 样品的采集 产物是什么？ →培养底物条件、产物特性…
什么类别的菌？→生长环境、耐受性、营养条件…
海底黑烟囱
1、样品的来源：以采集土壤为主。一般耕地、菜园和近郊 土壤中有机质丰富，土壤通气保水性好，以细菌和放线菌 为主；山坡上的森林土壤含有大量腐烂的植物枝叶，有机 质丰富，阴暗潮湿，酵母和霉菌较多。 5~25cm 土层的微 生物数量最多。 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
（a）扇形划线法
（b）连续划线法
（c）方格划线法
（d）平行划线法
（2）稀释分离法
单菌落分布均匀，获得纯种概率大，特别适合分离具 有蔓延性的微生物。
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
无菌水
固体培养各种微生物形成的菌落特征
http://ns2.auts.edu.cn/jwc/jpkc/shengji/2007/tangbinweishengwuxue/webpage/epage1.html
droplets
Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening
Brouzesa et al. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0903542106
Edwards et al. Analyst, 2013, 138, 339–345
菌落自动挑取、培养、检测
http://www.icr.ac.uk/ncri/coreresources/cancer_gene_cloning.html
http://www.genetix.com/f/core/frontend/http/http.php?dl=63754-image-1&inline=1
（2）化学方法
添加某些化学成分以增加特定微生物的数量。 如：添加几丁质的培养基用来分离放线菌；添加碳酸钙稳定培养基 的pH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质，如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行平板分离。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening
Mutagenesis
For further cultivation and screening Mutant library
Specially designed chip
（3）简单平板分离法 （4）涂布分离法 （5）毛细管分离法 （6）小滴分离法
（7）流式细胞仪
http://www.biomart.cn/50c35b041b9ab7bc011b9ab85433015f/info/1/all/index.htm
流式细胞仪就是进行流式细胞分析的 仪器，它集电子技术、计算机技术、 激光技术、流体理论于一体，是一种 非常先进的检测仪器。 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和 分布情况 分选感兴趣的细胞
Images and picks up to 30000 microbial colonies per day
This robot is used to pick colonies from agar plates into 96 or 384 well culture plates.
http://www.genetix.com/en/systems/qpix_systems/introduction/index.html
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约 10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料 袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等， 以备查考。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
2.2.2 样品的预处理 （1）物理方法
热处理、膜过滤法和离心法 热处理减少细菌数，以分离耐热的放线菌繁殖体、孢子和菌丝片段。 膜过滤法和离心法用于浓缩水中微生物细胞。
2.2.3 富集培养
为提高分离效率，可以根据微生物的生长繁殖对环境和营养要求 （温度、pH、渗透压、碳源和氮源类型及浓度等）的不同，使目的微 生物在最适条件下迅速生长繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势 菌种。
（1）控制培养基的营养成分
可加入相应底物作为唯一碳源或氮源 能在同一富集培养基上长的菌并非单一菌种，而是营养类型相同的 微生物群体，需进一步分离。
2.2 发酵工业菌种的分离筛选
发酵工业对菌种的要求：
①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的 产物量高、易于回收； ②生长较快，发酵周期短； ③培养条件易于控制； ④抗噬菌体及杂菌污染的能力强； ⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量 的稳定； ⑥对放大设备的适应性强； ⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物 质和毒素。
2.4 发酵工业菌种改良
菌种选育改良的具体目标
①提高目标产物的产量
生产效率和效益！
②提高目标产物的纯度，减少副产物
可有效降低产物分离成本。