[化学]第三章 分子荧光 光谱法
合集下载
分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
分子荧光光谱法
光致发光（Photoluminescence）: 荧光和
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
分子荧光光谱原理
首次建立了辣椒及辣椒素对照 品的三维荧光指纹图谱; 研究 表明，不同品种辣椒具有各自 特征的指纹图类型和特征指纹; 三维荧光指纹图谱可用来作为 鉴别辣椒品种和评价辣椒素含 量的有效手段
荧光光谱在食品中的应用
检测农药残留与污染物
同步荧光分析中，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星三种 药物光谱重叠严重在 pH =2.87 的 BR 缓冲溶液中，波长差 Δλ =190nm 时，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星的测量线 性范围分别为 0.016～0.40、0.01～0.336 和 0.01～0.336μg / mL; 检出限分别为0.0126、0.006 和 0.0072μg / mL。 采用恒能量同步荧光光谱法测定苯并芘 多环芳烃具有高荧光量子产率，可利用三维荧光光谱法进行测定
分子荧光光谱的特点
信息量大 灵敏度高
荧光不受来 自激发光的本底 的干扰，灵敏度 大大高于紫外可见吸收光谱， 测量用量很，方 法简便。 荧光光谱能提供较 多的参数，如激发 谱、发射谱、峰位、 峰强度、荧光寿命、 荧光偏振度等；还 可以检测一些紫外可见吸收光谱检测 不到的时间过程。
多元素测定
原子荧光 是向各个方向 发射的，便于 制作多道仪。
L/O/G/O
分子荧光光谱应用原理
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动 能级回到基态所发出的辐射，通常发生于具有刚性结构和 平面结构π 电子共轭体系的分子中。随着 π 电子共轭度和 分子平面度的增加，荧光强度随之增大，光谱相应红移， 其荧光光谱的形状和强度也相应发生变化，因此荧光光谱 是提供具有共轭结构的分子的组分分布与浓度大小的有效 测试手段之一。
分子荧光光谱分析的特点
虽然原子荧光光谱分析法有以上优点，但由于荧光 淬灭效应，以致在测定复杂基体的试样及高含量样品时， 尚有一定困难。此外，散射光的干扰也是原子荧光分析 中的一个麻烦问题。因此，原子荧光光谱分析法在应用 方面尚不及原子吸收光谱法和原子发射光谱法广泛，但 可作为这两种方法的补充。
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性，以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是，一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量，并从激发态到低能量的稳定态跃迁，从而释放出某种光，而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中，激发态是将能量投射到分子上，使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态，然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁，跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言，当激发态的分子能量超过一定的最低能量时，它将进入具有较低能量的稳定态，从而释放出光子。
通常说，这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质，它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物，也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题，可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应，也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点，可用于大量的物质的有效分析。
此外，它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而，分子荧光光谱法也有一些缺点，比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质，而且只有在激发态跃迁释放出荧光时，它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术，它具有敏锐的测量特性，可以快速、准确地测量多种物质，因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此，它的测量过程还简单易行，使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
第三章 荧光分析法
第3 章
荧光分析法
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
第3章 荧光分析法
3.1 概述 3.2 基本原理 3.3 分子结构与荧光关系 3.4 环境因素对荧光强度的影响 3.5 定量分析方法 3.6 荧光分光光度计 3.7 应用
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。 跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
3.2 基本原理
一.分子荧光的发生过程 (5)磷光的产生： 磷光的产生： 磷光的产生 由第一电子激发态三线态的最低振动能级跃迁到基 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 磷光能量比荧光小，波长比荧光长 磷光能量比荧光小， 注： 磷光不干扰荧光的产生 体系间跨越 发磷光 ∴发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 驰豫
Ft = F0e
− Kt
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
此时Ft （ ） 则上式为： 若t = τf , 此时 =（1/e）F0，则上式为：
F0 / e = F0 e
则K= 1/τf，将其带入 则得： 则得：
ln
− Kτ f
F0 t ln = Ft τ f
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
5.散射光的影响 散射光的影响 散射光： 散射光：光子与物质分子碰撞后使光传播的方向发生改变 而向不同角度散射。 而向不同角度散射。 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换， 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换，仅改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换， 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换，改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 散射光对荧光测定有干扰， 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射波长更长的 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大， 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大，必须采取措施消 除。
荧光分析法
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
第3章 荧光分析法
3.1 概述 3.2 基本原理 3.3 分子结构与荧光关系 3.4 环境因素对荧光强度的影响 3.5 定量分析方法 3.6 荧光分光光度计 3.7 应用
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。 跨越后，荧光量子减弱，甚至会荧光熄灭。
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
3.2 基本原理
一.分子荧光的发生过程 (5)磷光的产生： 磷光的产生： 磷光的产生 由第一电子激发态三线态的最低振动能级跃迁到基 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 磷光能量比荧光小，波长比荧光长 磷光能量比荧光小， 注： 磷光不干扰荧光的产生 体系间跨越 发磷光 ∴发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 发射时间长（在三线态上逗留一段时间） 驰豫
Ft = F0e
− Kt
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
此时Ft （ ） 则上式为： 若t = τf , 此时 =（1/e）F0，则上式为：
F0 / e = F0 e
则K= 1/τf，将其带入 则得： 则得：
ln
− Kτ f
F0 t ln = Ft τ f
化学化工学院
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
5.散射光的影响 散射光的影响 散射光： 散射光：光子与物质分子碰撞后使光传播的方向发生改变 而向不同角度散射。 而向不同角度散射。 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换， 瑞利光：发生弹性碰撞，无能量交换，仅改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换， 拉曼光：发生非弹性碰撞，有能量交换，改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 散射光对荧光测定有干扰， 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射波长更长的 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大， 拉曼光，因其波长与荧光接近，干扰更大，必须采取措施消 除。
分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
2019/12/31
待测样品设置
2019/12/31
空白校零
2019/12/31
开始测定
2019/12/31
2019/12/31
2019/12/31
重新计算
2019/12/31
2019/12/31
九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
2019/12/31
一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
2019/12/31
一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
2019/12/31
七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
2019/12/31
5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
2019/12/31
操作软件包
2019/12/31
定性分析操作
2019/12/31
预扫描
2019/12/31
2019/12/31
第三章 荧光分光光度法
螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；
分子发光光谱法
OH N
M OH
N
2021/2/4
1
21
4. 取代基的类型
• 对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类： （1）增强荧光的取代基 —— 有 -OH、-OR、 -NH2、
1
2
• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分 为以下几类：
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析
法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光
2021/2/4
1
3
二、分子荧光分析法的特点
二、激发光谱和发射光谱
固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波 长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图， 得到激发光谱曲线。
选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不 同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或 磷光光谱曲线。
2021/2/4
1
12
2021/2/4
1
13
三、分子荧光参数 1．量子产率 又称荧光效率
1
400 350
17
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发 生荧光
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定
• 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex =/2/4
1
18
2. 刚性平面结构——— 较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
2021/2/4
1
7
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
第三章 分子荧光光度法
测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
分子荧光光谱法 ppt课件
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
03第三章_分子荧光和化学发光解析
格也较低廉．
36
在流动注射进样方式中，传递分析物和反应物都是通
过泵来实现的，它的反应池是一个透明性良好的盘 管．分析时用泵驱动试剂进入流动系统，样品经注入 阀注入到反应试剂的溪流中，试剂和试样在流动过程 中进行混合（主要在盘管中混合），并在盘管中产生 化学发光，用置于盘管正前方的光电倍增管检测光信 号．流动注射式自动化程度高、分析速度快，便于连
NH2 O NH NH O O
N N NH2 [O]
*
COO－ COO
－
氧化剂
OH－
叠氮醌
NH2 O N. NH O
+ N2
单电子氧化 鲁米诺 游离基
3-氨基邻苯二 甲酸根阴离子
NH2 COO－ COO－
+ hv
(λmax=425nm）
28
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中可
被一些氧化剂氧化，产生最大发射波长为425nm 的化学发光．发光过程有两种方式，即单电子氧 化和双电子氧化，单电子氧化得到中间体鲁米诺 游离基；双电子氧化得到中间体叠氮醌，而最后
式中C*为能量给予体，而F为能量接受体．例如，用罗丹 明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3，其化学发光 反应就属这一类型．
21
没食子酸 + O3 A* + 罗丹明B 罗丹明B*
A* + O2 罗丹明B* + B 罗丹明B + hv
没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，
形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗
率，其反应机理为
NO + O3 NO2* NO2* + O2 NO2 + hv
分子光谱法
2. 配位场跃迁
有d→d* 跃迁和f→f*跃迁。这类跃迁 必须在配体的配位场作用下才有可能产生。
3. 金属离子影响下的配位体π→π*跃迁
吸光光度法中，所使用的显色剂大多数都 含有生色团，其本身为有色化合物，当与金属 离子配位时，作为配体的显色剂，其共轭结构 发生了变化，导致吸收光谱的红移或紫移。
二、 紫外可见分光光度计
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。
分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 照射后，仍能持续数分钟至数小时。
3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 放的化学能激发而产生的光辐射。
1. 电子跃迁的类型
基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键 电子和非键电子（以 n表示）。分子的空轨道包括 反键 *轨道和反键*轨道，因此，可能的跃迁为 *、*、n* n*等。
* *
跃迁能量大小：
n
σ→σ* > n→σ* > π→π* >
n→π*
*
*
n
1) σ→ σ* 跃迁：
饱和烃（甲烷，乙烷）
5）稠环芳烃及杂环化合物
稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带， 但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度 增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强 度也相应增加。
当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂 环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合 物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外，由 于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产 生n*吸收带。
能量最小，λ 200~400nm（近紫外区）
有d→d* 跃迁和f→f*跃迁。这类跃迁 必须在配体的配位场作用下才有可能产生。
3. 金属离子影响下的配位体π→π*跃迁
吸光光度法中，所使用的显色剂大多数都 含有生色团，其本身为有色化合物，当与金属 离子配位时，作为配体的显色剂，其共轭结构 发生了变化，导致吸收光谱的红移或紫移。
二、 紫外可见分光光度计
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。
分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 照射后，仍能持续数分钟至数小时。
3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 放的化学能激发而产生的光辐射。
1. 电子跃迁的类型
基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键 电子和非键电子（以 n表示）。分子的空轨道包括 反键 *轨道和反键*轨道，因此，可能的跃迁为 *、*、n* n*等。
* *
跃迁能量大小：
n
σ→σ* > n→σ* > π→π* >
n→π*
*
*
n
1) σ→ σ* 跃迁：
饱和烃（甲烷，乙烷）
5）稠环芳烃及杂环化合物
稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带， 但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度 增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强 度也相应增加。
当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂 环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合 物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外，由 于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产 生n*吸收带。
能量最小，λ 200~400nm（近紫外区）
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生，则称为荧光；若能在生，则称为荧光；若能在 s 或更长的时间后发生，则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理（一）（一） 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态（或更（或更高激发态）高激发态）的任一振动能级，的任一振动能级，的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区，在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
平面刚性结构效应 可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很
强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧 光，酚酞却没有。
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与
①荧光物质的吸光程度 ②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I）
I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可 以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的 扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长 λ2；
（2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的 扫描，确定最佳的激发光波长λ1 。
§3.2 荧光(磷光)分光光度计
一. 主要组成及部件的功能
激发单色器 光源
(2）环境因素
①温度 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加 荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低 10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80 ℃时，荧光 产率为100%。
②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。
pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生 变化。
氙 灯
光电倍增管样品池来自数据处理 仪器控制发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
仪器的主要部件
激发光源(light source) 样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是 激发荧光最灵敏的波长。
荧光发射光谱使激发光的波长和强度保持不变，而让荧 光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上， 亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵 坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。
荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发 射波长。
一、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，因 此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。
定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标准品 对照，看是否一致。
二、定量分析 1.标准曲线法：
F－F0
Fx －F0
2. 直接比较法
如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好， 可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和 试样的荧光强度，进行比较：
荧
光
荧光激发光谱
荧光光谱
强
度
200 250 300 350 400 450 500
激发光波长
荧光波长 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
2.激发光谱与发射光谱的关系 ➢ 镜像规则
荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有关 ，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。
S1
S0
➢ Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发射荧光
第三章 分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
本章主要内容
1 荧光分析法的基本 原理 2 荧光分析仪 3 荧光法的应用
4
什么是荧光？
自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能 量后，能发出不同波长和不同强度的光，一 旦外界能源消失，则这种光也随之消失，这 种光称为荧光。
Lambert-Beer 定律：
II0e2.303bc FKI0(1e2.30 b3 )c
= K I0 2 .30 b3 c( 2 .32 !0 b)3 2 c( 2 .33 !0 b)3 3 c
溶液浓度较低时：
FKI02.30b3c
当入射光的λ1 和 I0一定时 ：
F=Kc 即：
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比 荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光 很少应用于分析。
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
S1
能 量
T1
发
发
射
外转换
射
荧 光
磷 振动弛豫 光
S0
l
l l
l
4. 荧光产生的过程：
（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射， 吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电 子激发态的各个振动能级；
三重态能量较激发单重态低。
（2）激发态分子的失活
激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命 最短的占优势。
激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的方式回到 基态。
（3）失活的方式
①无辐射跃迁
振动弛豫： 由于分子间的碰撞，激发态分子由同 一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的 过程，其效率较高。 激发态分子常常首先发生振动驰豫。
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射 光的频率不同； 荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的 方向上检测； 荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照 射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关，测量用的样品量很 少，且测量方法简便。
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。
3、在生命科学中的应用 荧光成像
Cell
标记抗体的荧光纳米颗粒
目标细胞
Cell
被识别的目标细胞
分子信标
具有单碱基错配识别能力的分子信标探针，可以用于 检测单细胞内基因的表达、突变等
知识拓展—新型荧光材料
荧光量子点、荧光纳米簇、荧光聚合物点
1. 下列说法哪个是错误的？
Fs F0 Kcs Fx F0 Kcx
Fs F0 cs Fx F0 cx
cx
Fs Fx
F0 F0
cs
三、荧光分析法的应用
（1、 有机物的荧光分析
2、 无机元素的荧光分析
无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光 试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行 荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光 分析的元素已近70种。
5.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性 的体系才会产生荧光现象。 （2）具有一定的荧光量子产率。
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分发子射数的光子数 Φ= 激发态的分=子 吸数 收的光子数
1）荧光与分子结构的关系
要求：有强的紫外可见吸收
8 荧光光谱的特征
(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱 荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：保持荧光发射波长
不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节 激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强 度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以 荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常
数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应
含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且 最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物 也可能产生荧光。
取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而 给电子基会使荧光增强。
荧光： 受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫 到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐 射的形式失活回到基态，发出荧光。 由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失， 因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一 般比激发光波长长。
磷光：
若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重 态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐 射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。
3.1 分子荧光产生机理 1.光谱类型
荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发 射光谱。
2.跃迁类型 分子中原子的电子能
级跃迁，伴随振动能级 的跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定
频率的辐射，跃迁一次到位。
➢ 单重态： 一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。 ➢ 三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发
➢ 激发光源
能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、 高压汞灯或激光光源.
卤钨灯
高压汞灯
高压氙灯
➢ 样品池
It
It
IF,p
I0
I0
紫外-可见分光光度计 (吸收池)
荧光分光光度计 样品池
➢ 单色器 滤光片、棱镜、光栅
第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外光）， 称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2, 与激发光 入射方向垂直，称为荧光单色器。
（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐 射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；
（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到 基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就 是荧光：
（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最 后回到基态的最低振动能级．
在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7 .影响荧光强度的因素
（1）内部因素 自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自
猝灭随溶液浓度的增加而增加。 自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长
重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被 同类分子吸收，从而使荧光被减弱。