光遗传学技术在神经生物学领域的发展及应用_邴杰

2014年第49卷第11期生物学通报51光遗传学技术光遗传学技术是一种利用光学原理与基因工程相结合，使特定细胞类群表达或缺失某项功能的新兴实验技术。

基于该项技术目的性强、精确度高等特点，近年来，在复杂的生物学机制尤其是脑科学、神经科学等领域的研究中得到了广泛应用，被《Nature Methods》定义为2010年的年度新兴实验方法［1］，光遗传学技术被誉为21世纪神经生物学最有影响力的技术方法。

1.1光遗传学技术的发展过程光遗传学技术起源于神经生物学，1979年Francis Crick等认为神经生物学领域中面临的最大挑战是：如何在脑神经研究中精确控制一类被研究的神经元而不影响其他周边神经元的功能。

传统研究一般采用的方法是电极刺激或药物处理，然而电极刺激的针对性不强，药物处理作用时间周期太长、作用靶细胞多样等局限性因素，并不能很好地解决此类问题。

在20世纪70年代人们对光激活细胞表达机制还不是很清楚，Crick提出可否用光控制细胞中的特定事件。

40年前，微生物学家发现一些微生物可产生光门控蛋白，能直接调控质膜离子通道，1971年Stoeckenius和Oesterhelt研究发现细菌视紫红质作为一种离子通道能被光迅速激活，1977年Matsuno-Yagi和Mukohata发现了盐细菌视紫红质，Hegemann等发现了光敏感通道。

传统认为外来膜蛋白对神经细胞具有毒害作用，所以感光蛋白的研究并没有引起神经生物学领域学者的重视。

随着基因工程的发展和绿色荧光蛋白在生命科学领域的广泛应用，通过引进外来吸光复合物对相应蛋白进行研究示踪，人们才把视线重新转移到视蛋白的研究上。

2005年发现了一种微生物视蛋白，该视蛋白在没有添加任何化学或光敏感复合体的情况下就可以极为敏感地响应光刺激。

2010年研究证明通道视紫红质、细菌视紫红质和盐细菌视紫红质蛋白在不同光作用下对神经细胞可以迅速、安全地起到“开关”作用。

后期发现哺乳动物体内含有光控蛋白辅因子———全反式视黄醛，随着GPRS信号通路的研究发现，光遗传学的应用在活体哺乳动物体内具有更广阔的前景［2］。

1.2光遗传学技术作用机理生物体中存在一类膜蛋白可以感受不同波长光的刺激并对该光学刺激产生一系列效应的响应机制，该类蛋白被称为视蛋白（opsin）。

视蛋白属于一类视紫红质通道蛋白，可分为2种类型：typeI为一类微生物视蛋白，typeII为一类动物视蛋白。

两者均需要视觉色素视黄醛作为辅基。

视蛋白的种类和结构不同，导致蛋白对光的吸收峰有所不同。

2种类型视蛋白虽然都可编码7次跨膜的蛋白，但序列同源性系数极低，相似性系数跨度达到25%~80%［3］。

typeI 在原核生物、藻类和真菌中表达，是个庞大的亚家族，功能主要是感光和作为离子通道，作用原理为typeI编码的视紫红质通道蛋白与全反式视黄醛共价结合，当一定波长的光照时，全反式视黄醛异构化为13-顺式视黄醛，引起通道蛋白构象变化，打开离子通道，完成细胞生理功能；typeII在高等真核生物中表达，功能主要是视觉通路、昼夜节律和色觉分辨通路，作用原理为typeII基因编码GPCRS（G蛋白偶联受体），在黑暗环境中与11-顺式视黄醛结合，当视蛋白GPRS吸收光后，共价结光遗传学技术在神经生物学领域的发展及应用邴杰（北京师范大学生命科学学院北京100875）摘要光遗传学技术是基因工程学与光学相结合的一项新兴技术。

简要介绍了光遗传学技术的概念、发展过程及作用机理，概述了光遗传学技术中通道视蛋白的类型和该技术在神经生物学领域的应用。

关键词光遗传学技术视蛋白光学技术神经生物学中国图书分类号：Q31文献标识码：A6生物学通报2014年第49卷第11期合的视黄醛异构化为全反式视黄醛，与视蛋白水解，引起视蛋白构象变化，进而引发视觉通路的第二信使级联反应，光异构化后，GPCRS与视黄醛水解后，GPCRS再与新的11-顺式视黄醛开始新一轮的信号转导［2］。

该项技术的核心是将视蛋白膜通道蛋白用转基因学的方法，构建改造成能在生物活体组织或培养的细胞中稳定表达且不影响生物体自身正常功能的转基因蛋白，根据改造后不同的视蛋白结构、功能及吸光系数的不同，利用不同波长的光照射受体组织，从而引起转基因视蛋白构象改变，通道打开，产生相应膜内外离子差，造成膜电位改变，从而激活或抑制特定神经细胞活性，如下图所示。

该项技术在生物学领域可控制某一类细胞的激活或抑制，控制细胞生理机能，在研究大脑感觉、运动通路等重大神经生物学问题上有广阔的发展空间，可用于探究神经生物学行为学领域的疑难问题，以及细胞内部亚细胞结构定位与功能研究等生物研究领域［4］。

光遗传学技术作用机理图［2，5］2感光蛋白2.1细菌视紫红质（Bacteriorhodopsin BR）细菌视紫红质是盐生嗜盐菌（Halobacterium salinarium）等细菌的跨膜蛋白质，含有248个氨基酸，具有7次跨膜的α螺旋结构，216位的Lys通过希夫碱与视黄醛分子相连接，在吸收光能后,视黄醛由全反式视黄醛→13顺式视黄醛→全反式视黄醛，异构化作用触发细菌视紫红质构象变化,把质子从细胞质泵到细胞外。

最大吸收波长为560nm黄光［6］。

2.2盐细菌视紫红质（Halorhodopsin HR）盐细菌视紫红质通道蛋白是能被560~580nm黄光激活的介导Cl-的通道蛋白，阴离子内流引起神经元细胞超级化抑制神经元的活性。

早期发现NpHR 在高水平表达时会在细胞中产生聚合态影响该蛋白的功能，但是随后对NpHR改造后的2代eNpHR2.0和3代eNpHR3.0不会产生聚合体并且具有超级化功能。

最新筛选的微生物视蛋白Arch-3（Archaerhodopsin-3）细菌视紫红质和黑胫病视蛋白（Mac），当NpHR失活时，此2个离子泵被激发，进而可抑制神经元的活性［7］。

2.3视紫红质光敏感通道（Channelrhodopsin）视紫红质光敏感通道是一种光门控阳离子通道，在莱茵衣藻（Chlammydomonas reinhardti）中发现7次跨膜蓝光激活的非选择性阳离子通道蛋白，最大吸收波长为470nm。

光照下ChR2共价结合的全反式视黄醛变为13-顺式视黄醛，造成ChR2构象的改变，通道打开，细胞外阳离子大量内流，而阳离子内流造成神经元细胞去极化并激活动作电位。

最新工程学设计了ChR2突变体标记ChETA 标签，该标签可减少光相应中的双标记示踪，并且可以在200Hz下被光激活，远远超过许多细胞正常表达ChR2范围40~50Hz［8］。

2.4OptoXR OptoXR为视蛋白typeII型，应用GPCR信号通路在活体小鼠体内进行精确控制，OptoXRs是视紫红质-GPCR即G蛋白偶联受体的嵌合体，可被500nm的绿光激活后参与细胞内循环，OptoXRs细胞内进一步激活Gq、Gs或Gi，Gq激活下游IP3和DAG，或Gs和Gi可激活下游cAMP，该小GTPase在黄素或胆绿色发光团的参与下更易被激活［2］。

其中，GPCR不仅可响应多巴胺能、血清素和肾上腺能通路的信号传递，而且还可回应诸如GABA或谷氨酸酯等神经递质的信号传递功能［9］。

3光遗传学技术在神经生物学方面的应用光遗传学在生物学很多领域尤其是神经科学领域中取得了很大的进展［2］，利用光遗传学技术，已经能很好地解释一些神经生物学领域的现象。

在线虫中，2005年Nagel等发现被ChR2重组的线虫，其肌肉壁运动神经元和动力感觉神经元的活性是可控的；2007年Zhang等将ChR2和NpHR 双重组到秀丽隐杆线虫的肌肉壁细胞中，用光激活该细胞，发现肌肉壁细胞的收缩，这一现象与线虫受到外界机械刺激产生的反应一致；在斑马鱼躯体感觉神经元中的重复实验也表明，光激活下2014年第49卷第11期生物学通报7该神经元的反应驱动斑马鱼产生的游泳行为与通常的逃避行为很类似［10］。

Low等利用Gal4/UAS体系和光遗传学工具在斑马鱼的系统发生体系中成功检测并控制了斑马鱼心血管功能的发生机制。

在果蝇中，激活ChR2的上游基因序列研究果蝇疼痛机制和厌食反应机制时发现，一定波长的光波辐射可以打开ChR2通道，即引起神经递质一元胺的释放，一元胺进入血清素/多巴胺厌食循环，引起厌食反应［11］；与此同时在哺乳动物中利用光遗传学技术也取得了相应进展，在转基因小鼠中双重组ChR2和eNpHR后的一系列细胞神经元（例如下丘脑分泌素细胞、蓝斑核去甲肾上腺素激活神经元、VTA腹侧被盖区多巴胺神经元、棘神经元以及类胆碱能中间神经元）可以利用光波对这些神经元的活性进行精确控制；该技术的可控性已经应用到小鼠的睡眠与觉醒、多巴胺上瘾机制、奖赏机制以及可卡因依赖症等诸多方面，并取得了突破性进展；在转基因鼠Thy：：ChR2的研究中，鼠前额叶伽马震荡和信息处理的关系、运动皮层不同神经元的空间位置皮质突触抑制性及对杏仁核在恐惧和焦虑中的作用也有了不同的研究。

在大鼠中，利用光遗传学技术的精确可控性，将ChR2转基因到Cre转基因鼠系的特异神经元亚型，例如非儿茶酚胺能神经元，发现血氧水平依赖性回路功能和动物在麻醉与觉醒中的心血管功能、呼吸和血压的变化关系。

在研究果蝇norpA缺失突变体（无视觉）时，将eNpHR3.0重组进该突变体后，发现该突变体果蝇对蓝光非常敏感；在盲斑马鱼中的研究也发现将ChR2转基因到盲斑马鱼视网膜内层神经元后，26%的视网膜内层神经元对黄光的感应远远高于普通盲斑马鱼；在此基础上，将eNpHR2.0转入人体外培养的色素性视网膜炎相关细胞中，体外加入视黄醛后，发现培养的细胞具有了方向敏感性和光引导行为［2］，这些实验数据表明光遗传学在研究视觉通路及恢复视觉领域将有广阔的应用前景。

4前景随着光学技术的不断发展，微型光纤设备的研制开发及分子转基因技术在安全性上的不断成熟，可广泛地将光遗传学技术应用到神经生物学的各个领域。

该技术中重要的视蛋白在靶细胞中的表达、亚细胞中的运输机制等研究将扩大光遗传学在生物学领域的应用，如亚细胞的定位等。

在哺乳动物体内，typeII型光蛋白与G蛋白偶联的信号通路间的关系研究，将为研究激酶及转录因子等方面提供新的研究工具。

经细胞生物学修饰后，微生物视蛋白在活体人神经组织中具有强大的光遗传性功能，在人类健康方面，目前光遗传学只是作为一种研究工具，还不能直接用于人类的疾病诊断，例如对帕金森症的研究［9］，但随着该项技术的不断成熟，从2010年开始至今该技术已经在神经环路基础研究、运动障碍、睡眠焦虑等神经生物学的多个领域得到应用［12］，相信该项技术将在神经生物学领域及临床医学等各个方面取得更广阔的发展空间。

主要参考文献1Karl Deisseroth.Optogenetics.Nature Methods,2011,1(8): 26—29.2Lief Fenno,Ofer Yizhar,Karl Deisseroth.The Development and Application of Optogenetics.Annual Review of Neurosci-ence，2011,34:389—412.3Man D.,Wang W.,Sabehi G.et al.Diversification and spec-tral tuning in marine proteorhodopsins.The EMBO Journal, 2003,22:1725—1731.4Viviana Gradinaru,Feng Zhang,Charu Ramakrishnan et al.Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Exte-nding Optogenetics.Cell,2010,141:154—165.5Matthew E..Carter and Luis de Lecea,Optogenetic investiga-tion of neural circuits in vivo.Cell,2011,17(4):197—206.6Ryan Lumiere.A new technique for controlling the brain:optogenetics and its potential for use in research and the clinic.Brain Stimulation，2011,4:1—6.7Blaurock A.E.,Stoeckenius W..Structure of the purple mem-brane.Nature New Biology,1971,233(39):152—155.8Zhang F.,Gradinaru V.,Adamantidis A.R.et al.Optogenetic interrogation of neural circuits:technology for probing mamm-alian brain structures.Nature Protocols，2010,5:439—456.9Sugiyama Y.，Wang H.，Hikima T.et al.Photocurrent atten-uation by a single polar-to-nonpolar point mutation of chann-elrhodopsin-2.Photochemistry and Photobiology,2009,8(3): 328—336.10Arrenberg A.B.,Del Bene F.,Baier H..2009.Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.Proceedings of theNational Academy of A,2009,106:17968—17973.11Borue X.,Cooper S.,Hirsh J.et al.Quantitative evaluation of serotonin release and clearance in Drosophila.Joural ofNeuroscience Methods,2009,179:300-308.12Karl Deisseroth Circuit dynamics of adaptive and maladapt-ive behavior.Nature，2014,505:309—317.（E-mail:bingjie@）。