双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法
蛋白和核酸的分离方法
蛋白和核酸的分离方法1. 引言蛋白质和核酸是生物体内两种重要的生物大分子，它们在细胞的功能调控、遗传信息传递以及疾病发生发展等方面起着关键作用。
对于研究它们的结构、功能和相互作用，需要将其从复杂的细胞或组织中分离出来。
本文将介绍几种常用的蛋白质和核酸的分离方法。
2. 蛋白质分离方法2.1 离心法离心法是一种简单且常用的蛋白质分离方法。
通过利用不同蛋白质在离心过程中的沉降速度差异，可以将它们从混合物中分离出来。
一般情况下，使用超速离心机进行操作。
2.2 凝胶电泳法凝胶电泳法是一种基于蛋白质电荷和大小差异进行分离的方法。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
•SDS-PAGE：通过添加表面活性剂SDS使蛋白质带有负电荷，然后根据蛋白质的大小差异进行分离。
•PAGE：不添加SDS，根据蛋白质的电荷和大小差异进行分离。
2.3 柱层析法柱层析法是一种基于蛋白质在柱子中各种填料上的相互作用差异进行分离的方法。
常见的柱层析方法有：•尺寸排除层析：根据蛋白质的大小差异进行分离。
•亲和层析：利用特定配体与目标蛋白之间的特异性结合进行分离。
•离子交换层析：根据蛋白质与填料之间的电荷差异进行分离。
3. 核酸分离方法3.1 酚氯仿法酚氯仿法是一种常用的核酸提取方法，适用于从细胞或组织中提取总核酸。
其原理是利用酚和氯仿形成两相体系，使DNA或RNA从水相转移到有机相中，然后通过离心将核酸从有机相中分离出来。
3.2 硅胶柱层析法硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法。
通过将混合样品加入硅胶柱中，利用核酸与硅胶之间的亲和力差异进行分离。
根据不同的条件和方法，可以选择性地分离DNA或RNA。
3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法也可以用于核酸的分离。
与蛋白质的凝胶电泳类似，通过电场作用下核酸在凝胶中的迁移速率差异进行分离。
4. 结论蛋白质和核酸的分离是生物学、生物化学等领域研究的基础工作。
蛋白质的分离提取方法
蛋白质的分离提取方法
蛋白质分离提取是生物分析中一种常见的分析方法。
它能够从各种细胞和蛋白溶液中分离提取出有用的蛋白质，并有效地检测蛋白质的结构和功能。
一般来说，蛋白质分离提取的具体工艺如下：
1.抽提溶解：通常，抽提溶解的工艺是将细胞或蛋白溶液抽提成单独的溶液，再通过更细的滤器或繁复的曲折手段将其中的一些蛋白分离提取出来。
抽提的溶液可以是一种细胞因子或去离子水，也可以是添加有特定蛋白的溶液。
抽提的方法包括溶胀（如乳酸钠溶解）、离心离液（如凝胶离心）、沉淀（如滤渣沉淀）和浓缩（如滤渣浓缩）等。
2.冷冻干燥：冷冻干燥的技术是改变物质的温度以及蒸发蒸馏，以将抽提的蛋白质溶解体转变为晶体状态。
冷冻干燥的具体工艺主要有：先冷冻、改变气压、蒸发水份，再加热恢复溶液容量。
3.结构分离：结构分离是指对抽提的蛋白质进行多种物理和化学方法分离提取，通过改变结构和性质来识别和纯化特定蛋白质。
结构分离的方法包括电泳（例如乳糖电泳）、离心离液（例如凝胶离心）、层析（例如膜滤层析）等。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。
常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。
根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。
2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。
常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。
根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。
3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。
常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。
这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。
4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。
样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。
蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。
加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。
5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。
根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。
此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。
6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。
截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。
7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。
常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。
蛋白提取方法
蛋白提取方法蛋白是生物体内一种重要的有机化合物，具有多种生物学功能。
在生物医学研究、食品工业、药物研发等领域，蛋白的提取和纯化是非常重要的工作。
本文将介绍几种常见的蛋白提取方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
1. 细胞裂解法。
细胞裂解法是一种常见的蛋白提取方法，它通过破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
通常采用机械方法（如超声波破碎、高压破碎）或化学方法（如洗涤剂裂解）来实现细胞裂解。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大多数类型的细胞。
2. 亲和层析法。
亲和层析法是一种通过蛋白与特定配体之间的亲和作用来实现蛋白提取的方法。
常用的亲和层析配体包括金属离子、抗体、亲和标记物等。
通过将这些配体固定在固定相上，再将混合蛋白溶液通过柱子进行层析，从而实现对目标蛋白的选择性提取。
这种方法对蛋白的纯化效果较好，但成本较高。
3. 凝胶过滤法。
凝胶过滤法是一种通过分子大小差异实现蛋白提取的方法。
通常采用多孔性凝胶作为固定相，将混合蛋白溶液通过凝胶柱进行层析，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，对蛋白的形态和功能影响较小，适用于对蛋白分子大小要求较高的应用场景。
4. 盐析法。
盐析法是一种通过蛋白与盐溶液中离子相互作用的差异实现蛋白提取的方法。
在盐浓度逐渐增大的过程中，蛋白质的溶解度会发生变化，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，成本较低，适用于对蛋白的选择性提取要求不高的场景。
5. 超滤法。
超滤法是一种通过膜的孔径大小选择性分离蛋白的方法。
通常采用超滤膜将混合蛋白溶液进行过滤，从而实现对蛋白的提取。
这种方法操作简单，对蛋白的分离效果较好，但需要注意膜的选择和操作条件的控制。
总结。
蛋白提取是生物医学研究、食品工业、药物研发等领域中的重要工作。
本文介绍了几种常见的蛋白提取方法，包括细胞裂解法、亲和层析法、凝胶过滤法、盐析法和超滤法。
每种方法都有其特点和适用场景，研究人员可以根据具体的实验要求选择合适的方法进行蛋白提取工作。
蛋白质组学方法比较
蛋白质组学方法比较蛋白质组学是研究蛋白质在细胞、组织或生物体水平上的表达、修饰和功能的科学领域。
下面是蛋白质组学中常用的方法的比较：1. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：质谱法是蛋白质组学中最常用的方法之一。
根据质量-电荷比（m/z）分析蛋白质的分子量和结构，可用于鉴定蛋白质序列、翻译后修饰和互作蛋白等。
- 优点：高灵敏度、高分辨率、可定量、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：不适用于大规模分析、需要高度精确的质谱仪器。
2. 二维凝胶电泳（Two-Dimensional Gel Electrophoresis,2DGE）：2DGE 是将蛋白质通过等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，根据蛋白质的等电点和分子量进行分离。
- 优点：分离效果好、可获得蛋白质的相对丰度、可鉴定翻译后修饰。
- 缺点：不适用于低丰度蛋白质、定量不准确、有偏性。
3. 差异凝胶电泳（Difference Gel Electrophoresis, DIGE）：DIGE 是在2DGE的基础上引入荧光标记，同时分析多个样品的差异。
- 优点：高通量、高灵敏度、定量准确、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：需要昂贵的设备和试剂、荧光标记可能影响蛋白质性质。
4. 蛋白质微阵列（Protein Microarrays）：将蛋白质固定在固相载体上，通过与样品中的蛋白质相互作用来鉴定和分析蛋白质。
- 优点：高通量、高灵敏度、可进行蛋白质互作研究。
- 缺点：需要提前知道蛋白质的种类和性质、鉴定结果受固相载体和信号放大的影响。
5. 蛋白质组测序（Protein Sequencing）：通过将蛋白质的氨基酸序列解析出来来鉴定蛋白质。
- 优点：可以获得蛋白质的全序列。
- 缺点：需要大量的蛋白质样品、操作复杂、需要特殊设备。
5种蛋白双向电泳总方案
蛋白质双向电泳总方案一、植物蛋白的提取1Chloroform/acetone method: This method was performed according to the protocoldescribed by Xie et al. (2007), with modifications. The modifications included different tissue amount, reagent volume, and incubation time. These modifications also applied to the other three methods described below.About 0.5 g of leaf or 1.5 g of root sample was homogenized in 4.0 mL of extraction buffer (0.1 M KCl, 0.5 M tris-base at pH 7.5, 0.05 M EDTA, and 2% 2-mercaptoethanol) for 10 min. The mixture was shaken on ice for 2 h and centrifuged at 12,000 g for 15 min at 4°C. The supernatant was transferred to a new tube, and an equal volume of water saturated chloroform and isoamyl alcohol (24/1, v/v) was added. The tube was shaken at 4°C for 30 min and then stored on ice for 10 min before centrifugation at 10,000 g for 10 min at 4°C. The upper and bottom phases were removed. Then 4 mL of water was added to the interphase together with an equal volume of water-saturated chloroform and isoamyl alcohol (24/1, v/v); the mixture was homogenized, allowed to stand on ice for 10 min, and then centrifuged at 10,000 g for 10 min at 4°C. The treatment was repeated twice. The interphase was washed with ice-cold acetone three times. The final pellets were vacuum-dried and dissolved in resolubilization solution (8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 1% dithiothreitol [DTT], 1% pharmalyte).2 Phenol/ammonium acetate method: This method was developed following theprotocol described by Hurkman and Tanaka (1986), with modification. About 0.5 g of leaf or 1.5 g of root sample was homogenized in 4.0 mL extraction buffer (50% phenol, 0.45 M sucrose, 25 mM EDTA, 1% [v/v] 2-mercaptoethanol, 250 mM tris-base, pH 8.8) for 10 min. Samples were transferred to phenol-resistant screw-cap tubes and incubated on a mixer for 30 min at 4°C and then centrifuged at 5000 g for 10 min at 4°C. The upper phenol-phase was removed and added to five volumes of ice-cold 0.1 M ammonium acetate and 1% 2-mercaptoethanol in 100% methanol and then mixed before placing at –20°C for 2 h. Precipitated protein was collected by 10 min centrifugation at 12,000 g. Pellets were thoroughly washed twice with 20 mL of 0.1 M ammonium acetate in 100% methanol, followed by two washes with ice-cold 80% acetone,and a final wash with ice-cold 70% ethanol. The final pellets were vacuum-dried and dissolved in resolubilization solution.3 Tris-base/acetone method: This protocol was performed according to Rabilloud(1998), with modifi cation. About 0.5g of leaf or 1.5 g of root sample was homogenized in 4.0 mL of extraction buffer (40 mM tris-base, 5 M urea, 2 M thiourea,2% w/v CHAPS, 5% w/v polyvinylpyrollidone, and 2% 2-mercaptoethanol). The homogenate was centrifuged for 15 min at 12,000 g. The protein in the supernatant was precipitated by adding four volumes of ice-cold acetone containing 0.07% (w/v) 2-mercaptoethanol, incubated at –20°C for at least 2 h, and then centrifuged for 15 min at 12,000 g. The pellet was washed with ice-cold acetone containing 0.07%2-mercaptoethanol, incubated at –20°C for 2 h, and centrifuged again at4°C. The washing was repeated twice. The final pellets were vacuum-dried and dissolved in resolubilizationsolution.4 TCA/acetone method: This protocol was modified from the method described byDamerval et al. (1986). About 0.5 g of leaf or 1.5 g of root sample was homogenized for 10 min and incubated with 10 mL of precipitation solution (10% TCA and 0.07% 2-mercaptoethanol in acetone) for 2 h at-20°C. The precipitated proteins were pelleted and washed with ice-cold acetone containing 0.07% 2-mercaptoethanol to remove pigments and lipids until the supernatant was colorless. The pellet was vacuum-dried, resuspended in resolubilization solution,and sonicated to extract proteins. Insoluble tissue was removed by centrifugation at 21,000 g for 20 min.5 Mg/NP-40: Two grams of plant tissues were placed in liquid nitrogen and then stored at –80℃. The plant tissue was transferred to a prechilled mortar, and ground with a pestle in liquid nitrogen to a fine powder. The powder was homogenized in 10 mL of ice-cold Mg/NP-40 extraction buffer containing 0.5 M Tris-HCl, pH 8.3, 2% v/v NP-40, 20 m M MgCl2, 2% v/v β-mercaptoethanol, 1 m M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) and 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone(PVPP). After centrifugation at 12000g for 15 min at 4℃, proteins in the supernatant were precipitated by adding four volumes of cold acetone at –20℃for 30 min for analysis of total protein by 2-DE.注：除TCA/acetone外其它方法均为可溶性蛋白提取方法，在实验过程中发现用protein extraction buffer提取后的蛋白液用预冷的TCA/acetone含0.07%β-mercaptoethanol沉淀效果比纯丙酮要好！因此，可以考虑其它蛋白提取方案与TCA/acetone结合。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质电泳常用的几个实验
蛋白质电泳常用的几个实验
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE是最常用的蛋白质电泳技术之一。
它利用SDS(十二烷基硫酸钠)使蛋白质变性并带上均匀的负电荷,使蛋白质在电场中按分子量大小进行分离。
通过与蛋白质标准品对比,可以估算未知蛋白质的分子量。
2. 等电聚焦电泳(IEF)
IEF根据蛋白质的等电点(pI)来分离蛋白质。
在pH梯度凝胶中,带正电荷的蛋白质向阴极方向移动,带负电荷的蛋白质向阳极方向移动,直到达到其pI时停止移动。
IEF对分离具有相近分子量但不同pI的蛋白质非常有效。
3. 双向电泳(2D-PAGE)
2D-PAGE结合了IEF和SDS-PAGE的优势,是分离复杂蛋白质混合物的强大工具。
第一维是IEF,根据pI分离蛋白质;第二维是SDS-PAGE,根据分子量进一步分离。
这种方法可以同时分离出数百种蛋白质。
4. 毛细管电泳(CE)
CE是一种高效分离技术,使用很窄的毛细管作为分离介质。
根据不同的分离原理,CE可以分离蛋白质、DNA、糖类等多种生物分子。
在蛋白质分析中,CE常与质谱联用。
5. 免疫电泳
免疫电泳利用抗原-抗体反应来分离和鉴定蛋白质。
在凝胶中加入特异性抗体,抗原就会与抗体结合形成沉淀弧线。
可用于分离和纯化抗原,以及检测血清中的抗体。
根据不同的目的和样品特性,可以选择合适的蛋白质电泳技术来分离和鉴定蛋白质。
这些技术在生物化学和蛋白质组学研究中扮演着重要角色。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
一、凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它利用蛋白质的电荷和大小差异，在电场作用下，将蛋白质分离成不同迁移速度的带状物。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺糖凝胶电泳（PAGE）等。
凝胶电泳具有分离速度快、样品适用范围广、易于操作等特点。
二、离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography）：离子交换层析是根据蛋白质表面带电性的差异来分离纯化蛋白质的方法。
通过将样品加入装有离子交换树脂的层析柱中，通过控制洗脱缓冲液的离子浓度和pH，实现带正电荷或负电荷的蛋白质与树脂之间的相互作用，从而实现分离纯化。
三、亲和层析法（Affinity Chromatography）：亲和层析是利用蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来分离纯化蛋白质的方法。
常见的亲和层析方法包括亲和纸层析、亲和树脂层析等。
该方法具有选择性强、纯化效果好的优点，广泛应用于蛋白质纯化领域。
四、凝胶渗透层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶渗透层析也被称为分子筛层析，是一种以分子大小差异作为分离依据的方法。
通过在层析柱中加入一种孔隙较小的凝胶，利用蛋白质分子大小的差异，在经过柱体后，较小的蛋白质分子进入凝胶孔隙中，分离出来，而较大的蛋白质则能够直接流出。
五、逆流层析法（Reverse Phase Chromatography）：逆流层析是基于蛋白质与固定相之间的亲疏水性相互作用进行纯化的方法。
固定相常为亲疏水性的碳链，样品在不同的流动相条件下，通过调节流动相的成分和性质，来实现对蛋白质的分离纯化。
此外，还有疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）、互补杂交法（Complementary Hybridization）等方法。
分离提纯蛋白质的方法
分离提纯蛋白质的方法
分离和提纯蛋白质是生物学和生物化学研究中常见的技术方法，其目的是获得纯度高、结构完整的蛋白质样品，以便进行结构和功能研究。
下面介绍几种常见的蛋白质分离和纯化方法：
1. 离心分离法：利用离心力将不同密度的蛋白质分离开来。
该方法适用于分离不同分子量的蛋白质。
2. 溶液层析法：利用化学亲和性或物理特性将蛋白质分离开来。
常见的溶液层析法有离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
3. 电泳法：将蛋白质样品置于电场中，根据蛋白质的电荷、分子量或等电点等特性，将蛋白质分离开来。
4. 超滤法：利用超滤膜的筛选作用将不同分子量的蛋白质分离开来。
该方法适用于提纯分子量较小的蛋白质。
5. 氯仿法：利用氯仿的亲油性和蛋白质的亲水性差异，将蛋白质从混合物中提取出来。
6. 水相萃取法：利用蛋白质在水相和有机相中亲和性不同，将蛋白质从混合物中萃取出来。
以上是常见的蛋白质分离和提纯方法，不同的方法适用于不同种类和不同性质的蛋白质。
在实际操作中，需要根据样品的特点选择合适的方法进行分离和提纯。
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利用双向电泳比较3种提取户尘螨蛋白的方法
利用双向电泳比较3种提取户尘螨蛋白的方法孙劲旅;张宏誉;应万涛;王京兰;钱小红【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2004(024)003【摘要】为改进户尘螨过敏原提取方法,在采用Coca s液、裂解液及Trizol法提取纯种户尘螨螨体蛋白后,用二喹啉甲酸(BCA)检测法测定蛋白质含量,双向电泳比较上述蛋白提取方法的效果.结果显示,在蛋白质回收率方面,裂解液优于Trizol法优于Coca s液.经过双向电泳,Coca s液提取的蛋白仅仅有少量低分子量的蛋白点;用裂解液提取的蛋白可见明显增多低分子量的蛋白点,但无中分子量的蛋白点;Trizol法提取的蛋白可见中分子量的蛋白点如174～178ku和133.0ku的蛋白质.另外,纯种户尘螨螨体经Trizol液提取后进行双向电泳,在考染和银染时均出现5个高丰度的特殊蛋白点,一个为酸性中分子量蛋白,位置孤立的;另有4个位置彼此非常接近的中性蛋白点.比较后结论为使用Coca s液提取的尘螨蛋白质浓度低,蛋白点少.使用裂解液提取的尘螨蛋白质浓度虽然较高,但是没有中分子量的蛋白点,不能全面反映尘螨的过敏原.使用Trizol法提取的蛋白质浓度中等,有中分子量蛋白点,反映的蛋白点更加全面.纯种户尘螨螨体经Trizol液提取后进行双向电泳,在考染和银染时出现的特征性蛋白点,作为一种双向电泳的指纹图谱,在鉴定此种纯种户尘螨螨体时具有一定的价值.【总页数】6页(P321-326)【作者】孙劲旅;张宏誉;应万涛;王京兰;钱小红【作者单位】中国医学科学院,中国协和医科大学,北京协和医院,变态反应科,北京,100730;中国医学科学院,中国协和医科大学,北京协和医院,变态反应科,北京,100730;北京放射医学研究所,北京,100850;北京放射医学研究所,北京,100850;北京放射医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】R539.1【相关文献】1.适于双向电泳分析的水稻纹枯病菌菌体蛋白提取方法的比较 [J], 余功明;胡春锦;魏源文;史国英;岑贞陆;覃丽萍;黎起秦;黄思良2.改进的Coca's液提取户尘螨过敏原蛋白的效果探究 [J], 刘小萍;王莉;吴善东3.莲种子蛋白质提取方法比较与双向电泳分析 [J], 曹锐;陈浩;丁毅4.莲种子蛋白质提取方法比较与双向电泳分析 [J], 曹锐;陈浩;丁毅;5.适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较 [J], 陈晶瑜;郭宝峰;何付丽;曲春鹤;尹克鑫;杨洪达;赵长山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
分离提纯蛋白质的方法
分离提纯蛋白质的方法
1.色谱法：色谱法是一种使用固定相和流动相分离化合物的技术。
常用的色谱法包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析等。
这些方法能够根据蛋白质的分子大小、电性、亲和力等特性进行分离，并且具有高分辨率、高效率、高专一性等优点。
2. 聚焦电泳法：聚焦电泳法是一种利用电场将带电的蛋白质分
离的方法。
它利用不同的pH值和电场强度，将蛋白质分离成不同的
带电点，从而实现分离和提纯。
聚焦电泳法具有分辨率高、分离效率高、操作简便等优点。
3. 超滤法：超滤法是一种使用特定孔径的滤膜将蛋白质从混合
物中分离出来的方法。
它与分子量筛选有关，蛋白质的分离需要根据其分子量进行调整。
超滤法具有操作简便、成本低等优点。
4. 溶液沉淀法：溶液沉淀法是一种利用盐或其他沉淀剂将蛋白
质从混合物中分离出来的方法。
这种方法需要根据蛋白质的性质、溶液pH值等因素进行调整。
溶液沉淀法具有操作简便、成本低等优点。
总之，这些方法各有优缺点，需要根据实际情况选择合适的方法进行蛋白质的分离和提纯。
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蛋白质分离纯化常用哪些方法
蛋白质分离纯化常用哪些方法
蛋白质分离纯化方法有：
1、沉淀，
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析： a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
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双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
蛋白质差异分析：哪些方法能准确识别差异蛋白？
蛋白质差异分析：哪些方法能准确识别差异蛋白？蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于生命过程的调控和功能发挥起着关键作用。
在生物医学研究和药物开发中，准确识别差异蛋白对于揭示疾病机制和发现新的治疗靶点至关重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质差异分析方法，如二维凝胶电泳、质谱分析和代谢标记等，帮助读者了解如何选择适合的方法进行差异蛋白的识别与鉴定。
一、二维凝胶电泳。
1. 原理：二维凝胶电泳通过将蛋白质按照等电点和分子量进行分离，形成二维蛋白质图谱。
差异蛋白可以通过比较不同样品间的斑点强度差异来识别。
图1。
2.优势：相对简单易行、低成本、可以同时分析大量样品。
3.注意事项：对于低丰度和极酸性或碱性的蛋白质可能存在限制。
二、质谱分析。
1.原理：质谱分析通过测量蛋白质样品中的肽段质量和离子丰度，利用质谱仪器进行鉴定和定量分析。
2.优势：高灵敏度、高分辨率、可以识别和定量大量蛋白质样品。
3.注意事项：样品准备和数据分析的复杂性较高，需要专业技术支持。
三、代谢标记。
1. 原理：代谢标记是通过给不同样品施加特定的化学标记，使其在质谱分析中产生不同的质谱峰，从而识别差异蛋白。
2. 优势：能够定量分析蛋白质的动态变化，揭示生物过程中的差异表达。
3. 注意事项：标记剂的选择和反应条件的优化需要进行严格控制。
蛋白质差异分析是揭示疾病机制和发现新的治疗靶点的重要手段。
通过选择适合的方法，如二维凝胶电泳、质谱分析和代谢标记等，可以准确识别差异蛋白，深入了解生物过程中的差异表达。
在生物医学研究和药物开发中，蛋白质差异分析为我们解开生命的奥秘提供了有力支持。
图2。
蛋白质提取方法
蛋白质的提取方法有多种，主要包括以下五种：
1.水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。
提取时需要均匀搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成分性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
2.有机溶剂提取法：一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性和亲脂性，在溶解度范围内（度为10～20%），能避免变性，并起到保护酶的作用。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广（pH3～10），也适用于动植物及微生物材料。
3.超声波破碎法：通过使用超声波的机械波作用，使得细胞膜破碎，释放出蛋白质。
这种方法操作简单、操作快速，适用于处理小体积的样品。
4.溶液渗透法：该方法利用溶液渗透作用，通过梯度离心或薄膜渗透，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法适用于体积较小且溶解度高的蛋白质。
5.离心法：通过离心来分离混合物中的蛋白质。
根据蛋白质的分子量和比重差异，可以利用离心法将蛋白质从混合物中分离出来。
蛋白质分离的方法
蛋白质分离的方法引言：蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
蛋白质分离是研究蛋白质的关键步骤之一，它可以将复杂的混合物中的蛋白质分离出来，以便进一步研究和分析。
本文将介绍几种常用的蛋白质分离方法。
一、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离方法，它根据蛋白质的电荷、大小和形状差异进行分离。
常见的凝胶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）。
SDS-PAGE 是一种常用的单纯分子量分析方法，通过将蛋白质样品与 SDS 混合，使蛋白质带负电荷，然后在电场作用下，按照分子量大小进行分离。
2D-PAGE 结合了等电聚焦和 SDS-PAGE 两种方法，可以实现对复杂蛋白质混合物的高分辨率分离。
二、色谱法色谱法是利用物质在固定相或移动相中的吸附、分配、离子交换或分子筛作用，将混合物中的蛋白质分离出来的方法。
常见的色谱方法包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱和逆向相色谱等。
凝胶过滤色谱是根据蛋白质的大小选择性地通过孔径不同的凝胶柱进行分离，分子量较大的蛋白质在凝胶柱中滞留，分子量较小的蛋白质则通过柱床被洗脱。
离子交换色谱是利用蛋白质的电荷差异进行分离，根据蛋白质与固定相上离子交换基团之间的相互作用力进行分离。
亲和色谱则是利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合进行分离。
逆向相色谱则是利用蛋白质在有机溶剂和水之间的亲疏性差异进行分离。
三、电泳光谱法电泳光谱法是一种结合了电泳和光谱技术的蛋白质分离方法。
它通过在电泳过程中，利用光谱仪器对蛋白质进行在线检测，可以实时了解蛋白质的分离情况。
电泳光谱法可以通过对蛋白质的吸收光谱、荧光光谱等进行监测，实现对蛋白质的高灵敏度、高分辨率分析。
四、质谱法质谱法是一种基于蛋白质的质量-电荷比（m/z）进行分离和分析的方法。
质谱法包括质谱图谱（M S）和串联质谱（M S/M S）两种主要模式。
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ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年10月21(5):691～694・技术与方法・双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3(1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031)摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化中图分类号 Q503Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2Dimensional E lectrophoresisWE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3(1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics,Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China)Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE.K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006)3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@ 双向凝胶电泳(tw o2dimensional electrophoresis,22 DE)是蛋白质组学研究中分离蛋白质的主要技术之一[1],其原理是根据蛋白质等电点的不同在pH梯度胶内进行第一向等电聚焦分离,然后根据蛋白质的相对分子量大小利用聚丙烯酰胺凝胶进行第二向分离,经染色后得到二维的蛋白质分布图谱.双向凝胶电泳高分辨率分离蛋白质的关键是组织或细胞样品的制备,即蛋白质的提取.蛋白质提取一般使用含变性剂、表面活性剂和还原剂等成分的裂解液.其中,变性剂如尿素使蛋白质变性并使蛋白质水解酶失活;表面活性剂如CH APS促进蛋白质溶解;还原剂如DTT使蛋白质内的二硫键处于还原状态,有利于蛋白质的溶解.然而,目前的蛋白质样品制备方法存在着一些缺陷:①获得的样品中往往含有干扰物质,如盐离子、核酸、脂类和多糖等,从而引起蛋白质电泳行为的变化,其后果是不仅在一向电泳中干扰蛋白质的等电聚焦,而且会影响二向中蛋白质的迁移[2].②由于蛋白质溶解性的不同,约占细胞蛋白总量30%的膜蛋白在常用裂解液中很难溶解,导致二向图谱上出现的主要是可溶性蛋白质[3].③常用裂解液抽提方法步骤多、耗时长,容易引起蛋白质丢失和降解.因此,为适应不同组织或细胞的特殊理化性质,需要针对不同来源的样品进行蛋白质提取条件的优化,以获得足够量、高纯度的蛋白质样品用于后续实验.本实验以人乳腺癌细胞株MCF27为对象,比较了3种不同的蛋白质提取方法包括Pierce公司的哺乳动物蛋白抽提试剂M2PER、标准裂解液和添加硫脲的裂解液对22DE结果的影响,了解不同裂解液的提取效率以及它们与双向凝胶电泳条件的兼容性,从而建立了MCF27细胞总蛋白的相对最佳提取方法.1 材料与方法111 材料人乳腺癌细胞株MCF27购自AT CC公司(Number:HT B222)胎牛血清和改良型Eagle培养基(Dulbeccoπs m odified Eagleπs medium,DME M)购自Hyclone公司,胰酶为Invitrogen公司产品,固相pH梯度胶条、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、CH APS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和尿素等购自Bio2Rad公司,M2PER试剂为Pierce公司产品,硫脲购自Sigma公司,牛血清白蛋白为生物工程公司产品.细胞培养箱是F orma公司产品,分光光度计(SmartS pecT M3000spectrophotometer)、双向电泳设备(一向是PROTE AN IEF cell,二向是PROTE AN Plus D odeca Cell)和G S2800扫描仪是Bio2Rad公司的产品,超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝科器研究所,低温高速离心机和混合器由E ppendorf公司生产.112 细胞培养 MCF27细胞接种于含10%胎牛血清的DME M 新鲜培养基中,37℃常规培养于含5%湿润C O2的细胞培养箱里.待单细胞层近汇合时,胰酶消化,并以3×104细胞Πcm2的密度接种于直径为100mm的3个细胞培养皿(ORANGE,US A)中.24h换液后,继续培养24h提取蛋白质(此时每皿细胞数为1×107个).113 蛋白质提取M2PER试剂法:弃去皿中的旧培养基,用预冷的P BS洗细胞2次,加入M2PER试剂(500μl每107细胞),在冰上静置裂解5min后,迅速用刮棒刮下细胞,并收集到115ml离心管中.4℃、12000g离心8min后,取上清储存于-70℃备用.标准裂解法:离心收集胰酶消化的细胞后,用预冷的P BS洗细胞2次,然后每1×107细胞加1ml裂解液(8m olΠL尿素,4%CH APS,现加65mm olΠL DTT 和012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10),放于冰上静置裂解30min,再超声(180～200W,每次工作10s,间隔10s,共20次),最后以4℃,20000rΠmin离心1h,取上清储存于-70℃备用.硫脲裂解法:离心收集到的细胞经预冷的P BS 洗2次后,在1×107个细胞中加含硫脲裂解液(7 m olΠL尿素,2m olΠL硫脲,4%CH APS,现加65mm olΠL DTT和012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10)约1ml.后续步骤同标准裂解法.114 蛋白质定量参考文献[4]采用Bradford法定量,以牛血清白蛋白为标准蛋白.115 双向凝胶电泳取含250μg蛋白质的上述蛋白质提取液,用上样水化缓冲液(7m olΠL尿素,2m olΠL硫脲,4% CH APS,65mm olΠL DTT,012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10,01001%溴酚蓝)补充体积到300μl后,将17cm、pH4～7的固相pH梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方,被动水化12h,然后进行等电聚焦(17℃, 250V,30min;1000V,3h;10000V,5h;10000V, 60000Vh).聚焦结束后,分别用含2%DTT和215%296中国生物化学与分子生物学报21卷碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液(6m olΠL尿素,2% S DS,01375m olΠL T ris2Cl pH818,20%甘油)平衡胶条各15min.DTT是为了还原蛋白质的二硫键,而碘乙酰胺是为了去除多余的DTT.平衡完毕后,将胶条紧贴在12%的聚丙烯酰胺凝胶上方,进行第二向电泳(恒压200V,615～7h).电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色[4],然后用Bio2Rad的G S2800扫描仪扫描图像,所获图象用PDQuest711分析软件进行分析.实验重复3次.2 结果211 蛋白质定量M2PER试剂法提取的总蛋白浓度为41018 mgΠml,体积为015ml,总蛋白量为21009mg;标准裂解法提取的总蛋白浓度为31762mgΠml,体积为1 ml,总蛋白量为31762mg;硫脲裂解法提取的总蛋白浓度是315mgΠml,体积为1ml,总蛋白量为315mg.从以上结果可以看出,Pierce试剂提取的蛋白量与两种裂解液相比有较大差距,蛋白质提取效率没有后两种方法好.212 双向凝胶电泳所检测蛋白质的数量利用PDQuest软件自动统计22DE图谱上的蛋白质斑点数量.蛋白质斑点选定标准是:斑点个体独立,形态明显,3次实验重复出现.结果显示:M2PER 试剂法胶上蛋白点平均有1350±12个,标准裂解法胶上蛋白点平均为1326±10个,硫脲裂解法胶上的蛋白点平均为1368±9个.以上结果说明3种提取方法对蛋白质的检出数量影响不大.213 双向凝胶电泳图谱上蛋白质的分布Fig11A显示,M2PER试剂法得到的双向电泳图谱横纹多而明显,高丰度的蛋白点区域分辨率偏低(椭圆1区域),高分子量蛋白点(方框2区域)分离效果较差,独立蛋白点少.但在分子量为15～70kD、pH417～613的范围内(方框3所示),M2PER试剂法提呈的蛋白点多而集中,并存在很多只在本法中清楚显现的点,如箭头所指的椭圆区域4、5和6,说明该法适于提取偏酸性的70kD以下蛋白质.标准裂解法的图谱(Fig11B)横纹较少,高丰度 Fig.1 S ilver stained gel of tw o dimensional electrophoresisThe proteins were separated in the pI range between417and619,and m olecular weight between15kD and130kD (A)Proteins were extracted by using Pierce M2PER kit;(B)Proteins were extracted by using standard lysis bu ffer;(C)Proteins were extracted by using im proved lysis bu ffer蛋白点区域的分辨率比M2PER试剂法有所提高,蛋白点个体独立,形态清楚,同时蛋白质分布更广.在高分子量区域(>70kD),蛋白点分离效果明显增强,显现了一些新蛋白点,如箭头所指区域7,但在分子量为15～70kD、pH417～613的区域中蛋白点比M2PER法少.硫脲裂解法的图谱(Fig11C)与标准裂解法分布基本相似,但横纹是三者中最少的,且高丰度蛋白点396第5期翁 瑜等:双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 分离非常清楚,高分子量蛋白点(>70kD)分布除了区域7还扩展到箭头所指的区域8.从图谱上可见,相同的蛋白点在本法中的圆而大,即单个蛋白丰度增高,如箭头9和10所指.3 讨论从双向电泳图谱看,标准裂解法在高分子量区域的分辨率比M2PER试剂法有所提高,含硫脲裂解液对蛋白质的溶解性比标准裂解液强,所分离的蛋白点更多,形态更好,横纹相对更少,图谱分辨率更高.因此,我们认为硫脲裂解液更适合于MCF27细胞的蛋白质提取.但不足的是,硫脲裂解法和标准裂解法提取蛋白的步骤相对较多、耗时较长,可能会引起蛋白的降解.M2PER试剂法在提取分子量为15～70kD、pH417～613的蛋白质方面具有明显的优势,而且提取过程相对简单、方便、快速,有利于减少蛋白降解.但是,该法的蛋白提取量相对较少,难以获得高分子量蛋白,且可能由于盐离子等杂质较多,导致双向图谱中出现明显横纹,因此需要在双向凝胶电泳前对蛋白样品进行纯化.硫脲裂解液适合于提取双向凝胶电泳用蛋白质样品的原因是联合使用了硫脲、尿素和CH APS.研究表明,硫脲是高效率的变性剂,能溶于高浓度的尿素溶液,从而改善疏水性膜蛋白的溶解性[5].同时,硫脲和尿素联用能提高蛋白质在固相pH梯度胶条的溶解度[5,6].实验中使用的表面活性剂CH APS是兼性分子,不带净电荷,也溶解于高浓度的尿素溶液,从而进一步提高了蛋白质的溶解性.本法中采用DTT还原蛋白质中的二硫键,浓度为65mm olΠL,符合文献所推荐的浓度范围[2].虽然一些文献也报道不带电荷的还原剂T BP可以提高等电聚焦过程中蛋白质的溶解性,并有利于蛋白向S DS2PAGE胶的转移[5],但我们发现本实验中DTT和T BP对溶解性的影响并无显著差异.在蛋白质提取过程中,可以采用商品化的纯化试剂盒如Bio2Rad公司的clean2up试剂盒去除样品中少量的核酸、盐离子、脂类等干扰后续电泳的物质.我们在实验中也曾用它进行蛋白质纯化,但据我们观察,该试剂盒的纯化效率与样品来源相关,所以蛋白质纯化方法的选择仍需根据具体的实验进行摸索.我们认为,3种方法中以含硫脲的裂解液相对最适合MCF27细胞的蛋白质提取,与双向凝胶电泳条件的兼容性更好.参考文献(R eferences)1 S tanley B A,Neverova I,Brown H A,Van Eyk J E.Optim izing protein s olubility for tw o2dimensional gel electrophoresis analysis of human my ocardium.Proteomics,2003,3(6):815～8202 Shaw M M,Riederer B M.Sam ple preparation for tw o2dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2003,3(8):1408～14173 Santoni V,M olloy M,Rabilloud T.M embrane proteins and proteom ics: un am our im possible?Electrophoresis,2000,21(6):1054～10704 Ausubel F M,Brent R,K ingston R E,等著.颜子颖等译.精编分子生物学实验指南,第3版.北京:科学出版社,1999:332,361～363(Ausubel F M,Brent R,K ingston R E,et al.Short Protocols in Molecular Biology,3rd A:J W iley,1995)5 Herbert B.Advances in protein s olubilisation for tw o2dimensional electrophoresis.Electrophoresis,1999,20(4～5):660～6636 Rabilloud T,Adessi C,G iraudel A,Lunardi J.Im provement of the s olubilization of proteins in tw o2dimensional electrophoresis with imm obilized pH gradients.Electrophoresis,1997,18(3～4):307～316496中国生物化学与分子生物学报21卷。