药品微生物学检验技术
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物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基 上，23～28℃培养24～48小时
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌 数小于100 cfu/ml的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保
存在2～8℃可在24小时内使用
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15
菌悬液制备 (如何使浓度<100cfu/ml?)
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加 入3～5ml含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用
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18
中和剂或灭活剂
供试品有抑菌作用，可采用中和剂或灭活 剂，消除供试品的抑菌作用
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19
常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物
可选用的中和剂或灭活方法
戊二醛
亚硫酸氢钠
酚类、乙醇、吸附物
稀释法
醛类
稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐
季铵类化合物(QACs)、对 卵磷脂、聚山梨酯 羟基苯甲酸酯
汞类制剂
亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代 硫酸盐
若保存于密闭容器中，一般可在一年内使 用
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9
培养基的适用性检查
检查培养基是否无菌及灵敏度 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检
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10
培养基的无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支(瓶)，放置于 相应的温度下培养14天
培养基应无菌生长，表明所制备的培养基 达到无菌要求Fra Baidu bibliotek
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11
培养基的灵敏度检查
项目十四 药品的微生物学检验
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1
214页 附录5 思考以下问题：
要求无菌的生理盐水注射液如何检验 是否无菌？
有抗菌作用的青霉素粉针剂又如何检 验是否无菌？
口服药如何检验细菌数是否<1000/g？
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2
视频资源
供试品的制备
http://www.tudou.com/programs/view/iwTM9H1Bn98/
适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯 化钠溶液制成含孢子数小于100 cfu/ml的孢 子悬液。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在贮存 期内使用
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16
培养基接种及培养
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基 9支，分别接种上述浓度的金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌等4 种菌的菌悬液各2支，另1支不接种作为空白 对照，培养3天
无菌检查和微生物限度检查
http://so.tudou.com/isearch/%E6%97%A0%E8%8F%8C %E6%A3%80%E6%9F%A5/ （上）
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3
药品标准和食品标准是两套不同的体系。
药品微生物检验的验证更加严格：方法更 加可靠，且不易被供试品中的抑菌物质干 扰
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4
药品检验结果的可靠性来自于严谨的方 法学验证。为何规定要进行方法学的验 证？
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6
药品的无菌、微生物限度检查的验 证试验
方法：在采用的检验方法和过程中，通过 分别加入规定量的代表性微生物
以试验供试品是否在规定的检验量、在所 采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消 除了抑菌性(供试品本身的以及操作系统中 可能对微生物生长有影响的各种因素)
以试验所用方法对微生物生长无不良影响
厌氧菌有生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 〔CMCC(B) 64941〕
酵母菌有白色念珠菌(Candida albicans) 〔CMCC(F) 98001〕
霉菌有黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98003〕
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对试验菌株的要求
菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中 心获得的冷冻干燥菌种为第0代)
双胍类化合物
卵磷脂
碘酒、洗必泰类
聚山梨酯
卤化物
硫代硫酸盐
乙二胺四乙酸(EDTA)
镁或钙离子
磺胺类
对氨基苯甲酸
ß-内酰胺类抗生素
ß-内h 酰胺酶
20
无菌检查法的方法验证
目的：证明所采用的方法适合于该产品的 无菌检查 …是否有抑菌和干扰生长的现象
验证方法：
直接接种法
薄膜过滤法
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21
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙 醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直 接接种法培养基用量要求的改良马丁培养 基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠茵、 黑曲霉各2管。
许多药品本身具有抑菌性(如抗生素类药品、 含防腐剂药品)会对检查结果带来影响
样品的预处理方式、检验条件和培养条件 也都会影响到样品的微生物检测结果
检验方法的准确性、有效性和重现性
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5
药品微生物检查
无菌检查：药品物品是否呈无菌状态 微生物限度检查：物品中含有微生物的数
量 控制菌检查：是否有指定的病原菌存在
接种低浓度的试验菌株，培养观察生长情 况
培养基灵敏度判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基 管均生长良好，则说明该培养基可以使低 浓度的微生物也良好生长，表明培养基的 灵敏度符合规定
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12
试验菌株
需氧菌有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26003〕、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10104〕和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B)63501〕
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7
无菌检查所用的培养基制备
需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐流体 培养基
真菌培养基：改良马丁培养基 选择性培养基：对氨基苯甲酸培养基(用于
磺胺类药物的无菌检查)，聚山梨酸培养基 (用于油剂药品的无菌检查)
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8
培养基的保存
配制后灭菌，灭菌好的培养基应保存在 2℃～25℃、避光的环境
若保存于非密闭容器中，一般在三周内使 用
试验菌株用于试验时，细胞或孢子浓度需 小于100cfu/ml
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14
菌悬液制备 (如何使浓度<100cfu/ml?)
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营
养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物 至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培 养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养
取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分
别接种上述浓度的白色念珠菌、黑曲霉各2支，
另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日
观察结果。
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17
常用的稀释液、冲洗液
常用的稀释液有0.1%蛋白胨水溶液 常用的冲洗液有氯化钠-蛋白胨缓冲液 如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌
前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等以 达到预处理的目的
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌 数小于100 cfu/ml的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保
存在2～8℃可在24小时内使用
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菌悬液制备 (如何使浓度<100cfu/ml?)
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加 入3～5ml含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用
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中和剂或灭活剂
供试品有抑菌作用，可采用中和剂或灭活 剂，消除供试品的抑菌作用
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常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物
可选用的中和剂或灭活方法
戊二醛
亚硫酸氢钠
酚类、乙醇、吸附物
稀释法
醛类
稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐
季铵类化合物(QACs)、对 卵磷脂、聚山梨酯 羟基苯甲酸酯
汞类制剂
亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代 硫酸盐
若保存于密闭容器中，一般可在一年内使 用
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培养基的适用性检查
检查培养基是否无菌及灵敏度 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检
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培养基的无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支(瓶)，放置于 相应的温度下培养14天
培养基应无菌生长，表明所制备的培养基 达到无菌要求Fra Baidu bibliotek
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培养基的灵敏度检查
项目十四 药品的微生物学检验
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1
214页 附录5 思考以下问题：
要求无菌的生理盐水注射液如何检验 是否无菌？
有抗菌作用的青霉素粉针剂又如何检 验是否无菌？
口服药如何检验细菌数是否<1000/g？
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视频资源
供试品的制备
http://www.tudou.com/programs/view/iwTM9H1Bn98/
适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯 化钠溶液制成含孢子数小于100 cfu/ml的孢 子悬液。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在贮存 期内使用
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培养基接种及培养
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基 9支，分别接种上述浓度的金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌等4 种菌的菌悬液各2支，另1支不接种作为空白 对照，培养3天
无菌检查和微生物限度检查
http://so.tudou.com/isearch/%E6%97%A0%E8%8F%8C %E6%A3%80%E6%9F%A5/ （上）
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药品标准和食品标准是两套不同的体系。
药品微生物检验的验证更加严格：方法更 加可靠，且不易被供试品中的抑菌物质干 扰
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药品检验结果的可靠性来自于严谨的方 法学验证。为何规定要进行方法学的验 证？
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药品的无菌、微生物限度检查的验 证试验
方法：在采用的检验方法和过程中，通过 分别加入规定量的代表性微生物
以试验供试品是否在规定的检验量、在所 采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消 除了抑菌性(供试品本身的以及操作系统中 可能对微生物生长有影响的各种因素)
以试验所用方法对微生物生长无不良影响
厌氧菌有生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 〔CMCC(B) 64941〕
酵母菌有白色念珠菌(Candida albicans) 〔CMCC(F) 98001〕
霉菌有黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98003〕
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对试验菌株的要求
菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中 心获得的冷冻干燥菌种为第0代)
双胍类化合物
卵磷脂
碘酒、洗必泰类
聚山梨酯
卤化物
硫代硫酸盐
乙二胺四乙酸(EDTA)
镁或钙离子
磺胺类
对氨基苯甲酸
ß-内酰胺类抗生素
ß-内h 酰胺酶
20
无菌检查法的方法验证
目的：证明所采用的方法适合于该产品的 无菌检查 …是否有抑菌和干扰生长的现象
验证方法：
直接接种法
薄膜过滤法
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直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙 醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直 接接种法培养基用量要求的改良马丁培养 基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠茵、 黑曲霉各2管。
许多药品本身具有抑菌性(如抗生素类药品、 含防腐剂药品)会对检查结果带来影响
样品的预处理方式、检验条件和培养条件 也都会影响到样品的微生物检测结果
检验方法的准确性、有效性和重现性
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药品微生物检查
无菌检查：药品物品是否呈无菌状态 微生物限度检查：物品中含有微生物的数
量 控制菌检查：是否有指定的病原菌存在
接种低浓度的试验菌株，培养观察生长情 况
培养基灵敏度判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基 管均生长良好，则说明该培养基可以使低 浓度的微生物也良好生长，表明培养基的 灵敏度符合规定
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试验菌株
需氧菌有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26003〕、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10104〕和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B)63501〕
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无菌检查所用的培养基制备
需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐流体 培养基
真菌培养基：改良马丁培养基 选择性培养基：对氨基苯甲酸培养基(用于
磺胺类药物的无菌检查)，聚山梨酸培养基 (用于油剂药品的无菌检查)
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培养基的保存
配制后灭菌，灭菌好的培养基应保存在 2℃～25℃、避光的环境
若保存于非密闭容器中，一般在三周内使 用
试验菌株用于试验时，细胞或孢子浓度需 小于100cfu/ml
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菌悬液制备 (如何使浓度<100cfu/ml?)
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营
养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物 至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培 养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养
取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分
别接种上述浓度的白色念珠菌、黑曲霉各2支，
另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日
观察结果。
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常用的稀释液、冲洗液
常用的稀释液有0.1%蛋白胨水溶液 常用的冲洗液有氯化钠-蛋白胨缓冲液 如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌
前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等以 达到预处理的目的