动物细胞工程基础实验2

2. 材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL），无菌离心 管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒 精，酒精喷壶，抽纸，记号笔，橡胶手套，封口 膜
3. 仪器：生化培养箱，倒置生物显微镜，超净工作 台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱
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超净工作台的使用
1. 工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟；
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思考题
1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物 质，为什么？如何调节培养液的pH？
2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添 加，为什么？
3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法 有哪些，如何使用？培养基过滤后需要加 哪些物质？为什么？
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实验二 细胞传代培养
【实验原理】
1. 贴壁生长和悬浮生长。 2. 贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培
2. 关闭紫外灯，打开吹风和照明灯； 3. 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手； 4. 超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦
净。 5. 在超净工作台中摆放好试剂瓶。
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操作步骤
1. 观察细胞： 倒置显微镜 下观察细胞。 当细胞长满 瓶底时可以 传代。
EPC细胞
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2. 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具 用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台 酒精灯左侧；
3. 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严 禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培 养基）倾去，培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、 管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；
4. 清洗细胞表面：取一次性无菌移液管，安装好加 液枪，酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表 面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再 倒弃EDTA溶液；
EPC细胞（消化前）
EPC细胞（消化中）
EPC细胞（传代后） 37
思考题
1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事 项。
2. 常用的细胞消化液有哪些？ 各种消 化液的作用原理分别是什么？
3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？
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实验三 细胞原代培养
【实验原理】
1. 细胞培养分为原代培养和传代培养。 2. 原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械
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5. 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶 侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微 镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻 转培养瓶，使细胞脱离胰酶；
6. 中和消化：用移液管吸取2 mL新鲜生长培养基，加 入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打 消化好的细胞使其脱里瓶壁并分散；
常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 血清：小牛/胎牛血清。 动物细胞离体培养常常需要血清。血 清提供生长必需因子，如激素、微量 元素、矿物质和脂肪。
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鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞贴壁生长。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为 5%。
动物细胞工程基础实验
动物细胞工程
动物细胞工程，是应用细胞生物 学和分子生物学的理论和方法，按照 人们的设计，进行在细胞水平上的遗 传操作,从而获得新型生物。
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动物细胞工程常用技术
¾ 动物细胞培养技术 ¾ 动物细胞融合技术 ¾ 单克隆抗体技术 ¾ 胚胎移植技术 ¾ 细胞核移植技术
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动物细胞培养
细胞培养是指从动物活体中取出小 块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理 环境条件下，进行培养，使之继续生存、 生长、增殖。 9 原代培养 9 传代培养 9 细胞系
2. 拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶 （100 mL），每瓶50 mL。
3. 试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签， 封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明： 0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长 姓名。
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配制EDTA（ 0.2%）
1. 称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻 棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容 量瓶里，终浓度为0.2%，pH调为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。
养瓶底部长满，需要将细胞消化下来，并接种成 多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过 程就叫传代。 3. 细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供 实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之 一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
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【试剂、材料与仪器】
1. 试剂：生长培养基（PRMI-1640，添加10% 胎牛 血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA
9. 接种细胞：吸取4 mL上述的细胞悬液，加入原细胞 培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4 mL；
10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、 代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培 养；
11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进 行第2代的传代。
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EPC细胞（消化前）
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鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度
温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。 温度过高导致细胞死亡。 适宜的温度：25-28℃（温水性鱼类)、
15-20℃(冷水性鱼类)、37℃(水生哺乳 动物)。
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鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 HEPES 调节培养液的pH 至7.4左右。
4. 用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长 培养基内血清浓度为10%。
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超净工作台的使用
1. 工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟；
2. 关闭紫外灯，打开吹风和照明灯； 3. 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手； 4. 超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦
净。 5. 在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。
7. 去离子水条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
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实验室仪器设备
实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： • 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 • 干燥箱: 用于干燥 • 超净工作台: 用于无菌操作 • 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 • 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 • 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 • 液氮罐：用于细胞长期保存
7. 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中， 1000 rpm/min 离心8分钟，获得细胞沉淀；
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8. 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注 意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液 管吸取4 mL的新鲜培养基加入新培养瓶中，吸取4 mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细 胞悬液加入细胞培养瓶中混匀；
2. PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高 压灭菌备用；
3. 将PBS分装入试剂瓶中，瓶盖转松，牛皮纸包紧，橡皮 筋加固，装入提篮，121℃，20min灭菌；
4. 自然干燥冷却后，4℃保存备用。
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配制胰蛋白酶（0.25%）
1. 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制 的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
3. 胰蛋白酶（Trypsin）可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消 化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
4. EDTA溶液 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离 子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
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【试剂、材料与仪器】
1. 试剂：NaCl；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA； 胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS
2. 在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无 菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精 灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃ 冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、 以及组号与组长姓名。
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配制液体培养基
1. 将培养基干粉（PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加 800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈 橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量 瓶，用三蒸水定容至刻度。
3. 仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱
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实验准备
¾ 器皿：洗液浸泡冲洗/洗涤液刷洗--自来水 冲洗--三蒸水涮洗--烘干--包装高压灭菌
¾ 灭菌：干热、高压、紫外线、过滤 ¾ 洗液：浓硫酸+重铬酸钾 ¾ 包装：牛皮纸、饭盒、移液管盒、试剂瓶
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配制PBS（1000mL）
1. 分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ； KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分 溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度， pH7.2-7.4；
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考核方法
1. 平时成绩占20％（考勤和课堂表现） 2. 实验报告占60％（包括实验目的、原理、
步骤、结果（有图片及说明）、讨论以及 思考题。报告格式规范、详略得当） 3. 卷面考试占20％（名词解释、简答题、 分析题）
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修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
2. 材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量 纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试 纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次 性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机， 医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶 （500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸， 橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜