酶组织化学各论

pH4.3的醋酸水溶液轻洗切片；
⑧甘油明胶封片，光镜镜检。（非脂溶剂
稳定沉淀）
4.生物学意义
碳酸酐酶是催化CO2
水合反应和碳酸脱水反应的酶。此酶多见 于胃腺的壁细胞、主细胞、肾小管（近曲
小管基底部和管腔面刷状缘、远曲小管基
底部）、集合小管、小肠吸收上皮、红细
性部位。 （5）对照：采用去底物实验。
3.电镜显示法 （1）预处理： ①固定：2％戊二醛（0.1mol/L二甲胂酸
盐缓冲液，8％蔗糖，pH7.2～7.4）固定
60min；
②切片：冰冻切片机切片或振动切片机
切片40～50um。
（2）孵育液的配制：
醋酸盐缓冲液
对硝基酚磷酸钠
0.1mol／L（缓冲液）
（2）孵育液的配制：
3％β -甘油磷酸钠
1ml（底物） 10ml（缓冲液）
0.05mol醋酸盐缓冲液（pH5.0） 蔗糖 硝酸铅 使用。 0.8mg（和缓剂） 10mg（捕获剂） 孵育液最终pH值5.0，新鲜配制尽快
（3）操作步骤： ①新鲜组织，作冰冻切片或石蜡切片 ②10％福尔马林固定 10min ③蒸馏水洗 ④入孵育液，37℃ 2～4h（磷酸铅形成） ⑤双蒸馏水洗 2～3min ⑥入1％硫化铵液（新鲜配制） 1～2min （硫化铅形成） ⑦蒸馏水冲洗； ⑧甘油明胶封固。 （非脂溶剂稳定沉淀）
2）操作步骤：
①新鲜组织恒冷箱切片，福尔马林固定；
②入孵育液，室温或37℃ ③流水洗
④Mayer苏木精染色 ⑤流水冲洗 ⑥甘油明胶封固。
10～20min 3～5min
（有色沉淀形成） 4～6min（核复染） 5～6min （脂溶性沉淀）
3）结果与评价：酶活性部位呈黑
色，胞核呈暗褐色。
4.非特异性酯前的生物学意义 非特异性 酯酶主要定位于内质网和溶酶体，也可能有少 量存在于线粒体和胞液内。因此，光镜下整个 细胞质显示了酶活性的染色反应。非特异性酯 酶生理功能尚不清楚，目前认为主要参与酯类 物质代谢，也与蛋白质代谢活动有关系。 适用于：睾丸，卵巢，肾上腺，巨噬细胞 等的研究。
（3）操作步骤： 1）新鲜组织，冰冻切片； 2）冷10％福尔马林固定 10～20min 3）蒸馏水冲洗 2～3min 4）入孵育液，37℃，孵育 10～60min （磷酸铅沉淀形成） 5）蒸馏水洗 2～3min 6）入1％硫化铵 1min（硫化铅沉淀形成） 7）蒸馏水洗； 8）甘油明胶封固。（非脂溶剂稳定沉淀）
临用前将溶液Ⅰ与溶液Ⅱ混合，搅 拌 4min ，再静置 4min ，然后移至玻璃培
养皿中待用。注意搅拌时间需一致，以
保反应结果稳定。
（2）步骤： ①取材：新鲜冰冻切片； ②固定：可用多聚甲醛或戊二醛，如：
1％～2％戊二醛二甲胂酸钠缓冲液中固定
1～2h再分别以8％、10％、24％蔗糖溶液
泡过夜，然后洗净（未经固定的组织，其
3.0mmol／L（底物）
硝酸铅
3.6mmol／L（捕获剂）
（3）方法与步骤： ①新鲜组织，预固定并作冰冻切片40um； ②入孵育液，37℃，10～20nim（磷酸铅沉淀 形成）
③冷1％四氧化锇液后固定；
④95％乙醇脱水；
⑤环氧树脂包理；超薄切片；电子染色；
⑥电子显微镜观察。
（4）结果与评价：阳性沉集物为高电 子密度颗粒。 （5）对照：去底物对照，抑制剂对照，
二、酸性磷酸酶
酸性磷酸酶是一种在酸性环境下能水
解磷酸单酯的酶。其反应通式与碱性磷酸
酶相同。
酸性磷酸酶活性的检查法一般可分为 金属盐法和偶氮色素法。
1.金属盐光镜显示方法 （1）显示原理 显示酸性磷酸酶的铅法其基本机制类 似于显示碱性磷酸酶的钙-钴法，但因磷 酸钙在酸性溶液中是可溶性化合物，故改 用硝酸铅作捕获剂，最后与硫化铵作用生 成棕色硫化铅沉淀。
（3）操作步骤： ①新鲜组织，甲醛钙固定 10min ②冰冻切片或石蜡切片 ③蒸馏水洗 1～2min ④入孵育液，37℃ 10～60min（有色沉淀形成） ⑤双蒸馏水漂洗 2～3min ⑥l％甲基绿 1～2min（复染细胞核） ⑦蒸馏水漂洗 1～2min ⑧甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀）
（4）结果与评价：红色颗粒为酶活
的显色，可以证明酶的存在部位。
酚AS衍生物）与重氮盐偶联形成偶氮色素，
（2）嗜锇性硫酯法 在酶作用下，底 物硫酯被水解后，游离出的硫酚（含-
SH）立即与坚牢蓝BBN相偶联，形成嗜
锇酸性偶氮硫醚。经锇处理偶氮硫醚即
形成电子密度高的锇黑。
S-乙酰基-2-巯基苯酰替苯胺（TAB）
（3）硫代乙酸法
在酶的作用下，底
（2）孵育液的配制：
3％β -甘油磷酸钠 10ml（底物） 2％巴比妥钠 10ml（缓冲液） 2％氯化钙 20ml（捕获剂） 5％硫酸镁 5ml（激活剂） D.W 5ml 孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。
（3）操作步骤： ①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林 固定10min，或不固定） ②入孵育液，37℃孵育 30～60min （磷酸钙沉淀形成） ③蒸馏水冲洗 5min ④置2％硝酸钴内 2min（磷酸钴形成） ⑤蒸馏水冲洗 ⑥置1％硫化铵溶液内 1min（硫化钴形成） ⑦蒸馏水冲洗 ⑧甘油明胶封固 （非脂溶剂稳定沉淀）
（3）操作步骤： ①新鲜组织，作冰冻切片； ②入孵育液，37℃或室温 5～60min （有色沉淀形成） ③双蒸馏水冲洗 3～5min ④4％甲醛，室温下固定 10～50min ⑤蒸馏水冲洗 3～5min ⑥甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀）
（4）结果与评价：采用不同的重氮
盐，酶的活性显色也不同
萘酚法有三个优点：①反应产物溶解
（4）结果与评价：碱性磷酸酶活性产 物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物 可发生扩散，故定位欠准确。 （5）对照：从孵育液中去除底物或用
左旋咪唑等抑制剂的方法。
2.偶氮-偶联法光镜显示方法
（1）偶氮色素法的原理 偶氮色素法 是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚，以偶 氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使 用β －磷酸萘酯，通过酶的作用，水解生
物硫代乙酸游离出Baidu Nhomakorabea硫化氢与铅反应成为
硫化铅而沉着。此法的原理也应用于电镜
证明法。反应原理如下：
酯酶 Pb(NO3)2 CH3COSH —→ CH3COOH + H2S —→ PbS↓
2．α -萘基乙酸酯法 1）孵育液的配制： α -萘基乙酸酯 10mg（底物） 丙酮 0.25ml（促溶剂） 0.1mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 20ml（缓冲液） 坚牢蓝B盐 50～100mg（捕获剂） 搅拌过滤使用。
硝基酚磷酸钠。
5.酸性磷酸酶的生物学意义
酸性磷酸酶广泛分布于生物体内，一
般认为酸性磷酸酶位于溶酶体，是溶酶体
的标志酶。
三、三磷酸腺苷酶
ATP酶为水解ATP产生ADP和磷酸的酶。
ATP酶种类繁多，重要的ATP酶有： （1）细胞膜ATP酶 Na+、K+-ATP酶和 Ca2+、Mg2+-ATP酶。 （2）肌球蛋白ATP酶 因它可被Ca2+ 激活，故又称为Ca2+-ATP酶。 （3）线粒体ATP酶 Mg2+-ATP酶可被 Mg2+所激活。 （4）溶酶体膜ATP酶 H+、K+-ATP酶。
度小，局部比较明显；②萘酚化合物能比
较快地被水解，可缩短孵育的时间；③反 应产物立即可见，并显示出颜色。
3.柠檬酸铅电镜显示法 （1）预处理： ①固定：2％戊二醛（0.1mol／L二甲 胂酸缓冲液，8％蔗糖，PH7.2～7.4）， 固定60min；或4％多聚甲醛固定数小时至 12h。 ②切片：冰冻切片机或振动切片机切 片40～50um。
（4）结果与评价：反应阳性部位呈
棕褐色硫化铅颗粒。该酶是可溶性酶，
以冷固定后结果较满意。
（5）对照：①去底物对照；②抑制
剂对照：特异性酶抑制剂是氟化钠（NaF， 4.2mg／10ml）。
2.偶氮色素光镜显示方法 （1）显示原理 酸性磷酸酶是使底物的醇部分脱磷酸
化，以偶氮色素的形式捕捉。以萘酚或其
衍生物磷酸酯作为底物，经酶作用游离出
萘酚或其衍生物，与重氮盐作用形成偶氮
色素，显色于酶活性部位。
（2）孵育液的配制： 萘酚AS-BI磷酸盐 5mg（底物） 溶于二甲基甲酰胺液 0.25ml（促溶剂） 10％氯化镁 2滴（激活剂） 蒸馏水 25ml 0.2mol醋酸盐缓冲液（pH5.2～5.6） 25ml（缓冲液） 红紫罗兰IB盐 30mg（捕获剂） （或其他重氮盐） 以上充分搅拌、溶解、过滤后使用。
硝酸铅法显示Mg2+激活的三磷酸腺苷酶 （Mg2+-ATPase） （1）原理：ATPase水解磷酸之间的高能键， 释放大量能量，而不能水解磷酸与碳之间的键。 释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，经硫化铵 处理形成硫化铅沉淀显色。
（2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷二钠 10mg（底物） 0.2mol/L Tris-HCl（pH7.2） 10ml（缓冲液） 0.1mol/L MgSO4 2.5ml（激活剂） 2％Pb(NO3)2 1.5ml（捕获剂） 蔗糖 1.8g（和缓剂） 双蒸馏水 加至25ml 配制时Pb(NO3)2要逐滴加入，并随时搅拌， 使充分混合至无色透明或过滤后使用。
酶组织化学各论
一、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶在碱性环境下能催化各种 醇和酚的磷酸酯水解。其反应通式如下：
1.钙-钴法光镜显示方法 （1）钙-钴法的原理 碱性磷酸酶将 磷酸盐的底物分解产生磷酸离子为孵育液 中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，加入硝 酸钴，使之转变为磷酸钴沉淀，再通过硫 化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀， 以显示酶活性所在部位。
CAH活力可减低5％～10％）；
③切片：新鲜组织或经固定的组织块用恒 冷切片机切片，10～20um ④孵育：孵液中漂浮，室温下4～12min
（无色氢氧化钴沉淀形成）
⑤洗涤：蒸馏水洗，再以0.01mol Na2HPO3
或 K2HPO3洗 1～3min
⑥2％硫化铵 1～2min（有色沉淀形成）
⑦洗涤：先用蒸馏水，再用 0.01mol／L
（4）结果与评价：酶活性处呈棕黑色 硫化铅沉淀。电镜下阳性沉集物为高电子 密度颗粒。
（5）对照：
①除去底物，则反应为阴性；
②以β -甘油磷酸钠代替底物，显示染
色反应为碱性磷酸酶的定位。
四、非特异性酯酶 1．反应原理 （1）偶氮色素法 在酶的作用下，从
底物游离出来的α -萘酚（或β -萘酚、萘 同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素
成的β －萘酚，后者为重氮盐捕捉，生成
红色的偶氮色素沉淀。
（2）孵育液的配制： 萘酚AS（或萘酚AS-MX）10～25mg（底物） N，N-二甲基甲酰胺液 0.5ml（促溶剂） 0.2mol/L Tris－盐酸（pH9.2） 50ml（缓冲液） 坚牢蓝B 50mg（捕获剂） 以上混合和过滤，必要时可用氢氧化 钠调整pH9.0～9.2值。
五、碳酸酐酶 1．反应原理 目前，组织化学中显示碳酸酐酶的方 法有三种： 1）用同位素标记的抑制剂与酶相结 合的放射自显影术； 2）应用抗体的免疫组织化学法； 3）酶反应物的金属盐沉淀法。
现在最常用的是金属盐反应法。
2．光镜显示法 （1）孵育液的配制： 溶液Ⅰ： 0.1mol／L CoSO4 0.5～5ml（捕获剂） 0.5mol／L H2SO4 3ml（中和剂） 0.067mol／L KH2PO4 0.5ml（缓冲液） 蒸馏水加至总量 8.5ml 溶液Ⅱ： NaHCO3 380mg（底物） 溶于双蒸馏水20ml中 （使用前新鲜配制）
（2）孵育液的配制： 0.2mol／L Tris-HCl（pH8.5） 1.4ml（缓冲液） 3％β -甘油磷酸钠 0.015mol／L MgSO4液 蔗糖 0.5％柠檬酸铅 2.0ml（底物） 2.6ml（激活剂） 0.5g （和缓剂） 4.0ml（捕获剂） 共计 10ml（pH9.0～9.4）
（3）方法与步骤： ①新鲜组织，或甲醛固定并作冰冻切片40um； ②入孵育液，37℃，孵育 15～30min； ③蒸馏水洗； ④冷1％锇酸（OsO4），30min； ⑤蒸馏水洗； ⑥梯级酒精脱水； ⑦环氧树脂包埋，超薄切片，电子染色； ⑧电子显微镜观察。
（4）结果与评价：磷酸铅呈现高电 子密度颗粒，主要分布在细胞膜上。 （5）对照：孵育液中去除底物或加 入抑制剂（如β 苯丙氨酸或四唑或溴四 唑），则酶活性为阴性。