高效液相色谱法测定舒络灵酊剂中次乌头碱的含量.

高效液相色谱法测定舒络灵酊剂中次乌头碱的含量
作者：陈晓颖，梁基智，梁松庆，黄文立
【摘要】目的建立舒络灵酊剂中次乌头碱的含量测定方法。

方法采用高效液相色谱法，色谱柱为DiamonsilTM C18，流动相为乙腈体积分数0.2％冰醋酸（用三乙胺调节pH 5.80）（体积比29∶71），流速1.0 mL/min，检测波长230 nm。

结果次乌头碱在10.2～102.0 μg/mL范围内线性关系良好（r=
0.9999），次乌头碱的平均回收率为99.2％，方法精密度RSD值为2.56%
（n=6）。

结论该法可用于舒络灵酊剂的质量控制。

【关键词】舒络灵；次乌头碱；RP HPLC
Abstract:Objective To establish a method for content determination of hypaconitine in Shuluoling tincture. Methods An HPLC DiamonsilTM C18 column was used to analyze the sample. The mobile phase consisted of acetonitrile0.2% acetic acid (adjusted to pH5.80 by triethylamine) (29∶71). The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength 230 nm. Results The linear range of hypaconitine was 10.2～102 μg/mL (r=0.9999). The average recovery
for hypaconitine was 99.2% with RSD 2.56%(n=6). Conclusion The method can be used for the quantitative determination of hypaconitine in Shuluoling tincture.
Key words:hypaconitine；Shuluoling tincture；RP HPLC
舒络灵酊剂是由生川乌、防风、桂枝、独活、红花、淮牛膝等二十多种中药材制成的中药制剂，具有活血化淤、消肿止痛和行气祛湿的功效，临床用于急性闭合性软组织扭伤、挫伤引起的局部肿胀、疼痛、青紫、淤斑等症的治疗。

方中生川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的干燥母根，其主要成分为二萜类生物碱，如双酯型的乌头碱、新乌头碱、单酯型的苯甲酰乌头碱等。

双酯型乌头碱类呈现强烈的毒性［1］，为保证临床用药安全有效，有必要对舒络灵中的双酯型生物碱进行质量的控制。

由于生川乌的毒性有效成分双酯型生物碱中乌头碱的含量最低且最不稳定，而次乌头碱含量最高且稳定
性较好，所以选用次乌头碱作为评价指标。

本文建立了舒络灵中次乌头碱含量测定的反相高效液相色谱法，该法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于该产品的质量控制。

1 仪器与试剂
LC10AT型高效液相色谱仪（日本岛津），SPD10AT型紫外可见检测器（日本岛津），HW2000色谱工作站。

次乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所， 110798200404）；舒络灵酊剂（广州市中医医院）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备精密称取次乌头碱对照品适量，用三氯甲烷异丙醇（体积比1∶1）混合溶剂溶解并稀释成质量浓度为1.02 mg/mL的对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备精密量取舒络灵50 mL，置50 ℃水浴上挥干乙醇，加入0.5 mol/L硫酸30 mL，超声2 min，过滤至分液漏斗中，用0.5 mol/L硫酸溶液50 mL洗涤蒸发皿及滤纸，合并酸液，用乙醚提取4次，每次30 mL。

乙醚层用30 mL酸液洗涤后弃去，合并酸液，用氨试液调pH值至10，用乙醚提取4次，每次30 mL，合并乙醚提取液，置50 ℃水浴中挥干，残渣加三氯甲烷异丙醇（体积比1∶1）溶解并定容至2 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 阴性对照液的制备取处方组成中除生川乌外的其余成分制成不含生川乌的阴性对照品，按“2.1.2”项下的制备方法处理得阴性对照液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱为 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司），流动相为乙腈体积分数0.2%冰醋酸（用三乙胺调节pH值5.80）（体积比29∶71），流速为1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温为室温。

分别取对照品溶液（质量浓度为81.6 μg/mL）、供试品溶液和阴性对照液10 μL注入色谱仪，理论板数以次乌头碱计算应不低于5 000；次乌头碱的拖尾因子为1.04，保留时间约为28.8 min，次乌头碱与其他组分可基线分离；阴性样品不干扰样品测定，见图1。

图1 次乌头碱对照品（A）、舒络灵样品（B）、缺生川乌阴性样品（C）高效液相色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of standard (A) and sample (B) and negative control (C)
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线制备分别吸取一定量的次乌头碱对照品贮备液，加三氯甲烷异丙醇（体积比1∶1）混合溶剂稀释成次乌头碱质量浓度为10.2、30.6、51.0、81.6、102.0 μg/mL的溶液。

依次进样10 μL，每个质量浓度测定3次以上。

以峰面积（A）对对照品溶液质量浓度（ρ）进行回归，得次乌头碱回归方程A=7 372.6ρ329 03，r＝0.999 9。

表明次乌头碱质量浓度在10.2～102.0 μg/mL之间与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度试验取质量浓度为81.6 μg/mL的次乌头碱对照品溶液10 μL连续测定5次，其峰面积的平均值为26 824，RSD为1.02%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验取舒络灵酊剂（批号070410），照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h进样10 μL，记录峰面积。

结果峰面积的RSD为2.99%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验取同一批号（070410）样品6份，照“2.1.2”方法处理并测定，结果次乌头碱平均含量为0.688 4 μg/mL，RSD为2.56%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5 加样回收试验精密称取同一批号样品（070410）共6份，加入相应量的次乌头碱对照品，照“2.1.2”方法处理并测定，计算回收率，结果见表1。

次乌头碱平均回收率为99.2%，RSD=1.72%。

结果表明本方法准确可靠。

表1 次乌头碱加样回收试验结果（略）
Tab.1 Recovery of the assay
2.4 样品测定
取舒络灵酊剂3批，照“2.1.2”方法制备供试品溶液并测定，每批样品测定3份。

计算样品中次乌头碱的含量，结果见表2。

表2 舒络灵中次乌头碱的含量测定结果（略）
Tab.2 Determination of hypaconitine in sample（n=3）
3 讨论
一般文献是在碱性条件用乙醚提取生川乌中的次乌头碱［2-6］。

本品由于组方药味较多，用上述方法制备的供试液干扰很大，因此在除去酊剂中的乙醇后，先用酸液使次乌头碱成盐，再滤过除去部分脂溶性杂质，进一步用乙醚除去大部分的脂溶性杂质后，再用碱性乙醚提取。

根据空白干扰试验和回收率试验，证实此法既可排除干扰，又可达到提取完全的目的。

由于舒络灵的组方复杂，干扰成分较多，本文参照文献［7］，对流动相进行优化，结果以乙腈冰醋酸（用三乙胺调节pH值5.80）（体积比29∶71）为流动相时分离效果最好；流动相的pH对次乌头碱的稳定性有影响，实验结果表明pH为5.80时含量测定结果重复性最好，这与张聿梅等［8］的实验结果一致。

本文方法快速、准确，重复性好，可作为舒络灵的质量控制方法。

【参考文献】
［1］杨芬明，曾利纯.实用毒性中药学［M］.北京：科学技术文献出版社，1997：27-32.
［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：27.
［3］薛燕，袁汉成用于碱性生物碱的分离［J］.药物分析杂志，2003，23（2）：94-97.
［4］陶淑娟，邵太丽，毕开顺法测定蒙药那如-3丸中乌头类生物碱含量［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（3）：197-199.
［5］王兆基，关锡耀，徐树棋，等.毒性中药生川乌质量标准研究［J］.中成药，2006，28（5）：651-655.
［6］郑杭生，冯年平.中药饮片制川乌、制草乌中乌头碱、次乌头碱的HPLC测定［J］.药物分析杂志，2005，25（1）：34-36.
［7］唐洪梅，黄月纯，曾惠芳，等.高效液相色谱法测定祛风通络散中次乌头碱的含量［J］.中药材，2005，28（5）：420-422.
［8］张聿梅，鲁静，蒋渝，等.川乌和制川乌中单酯及双酯型生物碱成分的含量测定［J］.药物分析杂志，2005，25（7）：807-812.。