第四章 免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术就像是细胞世界里的一场绚丽灯光秀。
想象一下，细胞们不再是那些只能在显微镜下灰扑扑地被观察的小不点，而是摇身一变成为舞台上闪耀的明星。
这个技术就像是给细胞们穿上了五彩斑斓的荧光衣裳。
那些抗体就如同超级精确的裁缝，专门为细胞量身定制“荧光服饰”。
它们能精准地找到细胞上特定的蛋白质分子，就像最厉害的寻宝猎人，在细胞这个大迷宫里一下子就能锁定目标。
如果把细胞比作一个装满各种小物件的大盒子，免疫荧光细胞化学技术就是那盏超级亮的手电筒，一下子就能照出我们想要找到的特定小物件（也就是特定的蛋白）。
而且这个“手电筒”还特别炫酷，发出的是五颜六色的荧光。
它的检测过程就像是一场神秘的魔法仪式。
各种试剂在细胞周围穿梭，就像一群忙碌的小精灵，在为细胞打造独特的荧光效果。
有时候感觉那些荧光标记就像是细胞的秘密纹身，只不过这个纹身是为了让科学家们更好地了解细胞的秘密。
当我们在显微镜下看到被标记后的细胞时，那简直就像是看到了一个微观的梦幻星球。
那些发着荧光的细胞结构就像星球上独特的地貌，有明亮的山脉（可能是细胞膜），有闪烁的湖泊（或许是细胞质中的某些结构）。
这个技术还特别爱搞“微观cosplay”呢。
它能把细胞模仿成我们想要研究的各种状态，通过荧光标记的变化，就像细胞在说：“看，我现在是生病的状态啦”或者“我现在正在努力分裂繁殖呢”。
要是细胞会说话，它们肯定会对免疫荧光细胞化学技术又爱又恨。
爱的是它们可以借此展示自己独特的魅力，恨的是自己的小秘密都被这个技术暴露无遗。
在科学研究的大舞台上，免疫荧光细胞化学技术就像一个多才多艺的明星。
它既可以在基础医学研究里当主角，帮我们弄清楚细胞的正常生理机能；又能在疾病研究中大展身手，就像一个超级侦探，追踪那些病变细胞的蛛丝马迹。
不过这个技术有时候也有点小脾气。
如果操作不当，就像一个被打乱节奏的乐队，整个荧光标记就会乱套，给研究者们带来一堆头疼的问题。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光化学技术
免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons等(1950)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。
(SPA)、生物素与卵白(ConA(FACS) 它与葡萄球菌A 蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素 (ConA 等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机， 扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器 (FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世， 使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段， 开创了免疫荧光技术的新领域。
由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。
(( 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体 (或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原 (或抗体)。
利用荧光显微镜观察标本时，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光( 黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
免疫荧光细胞化学的原理 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法。
一、直接方法(direct method)(direct method) ㈠检查抗原方法 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。
直接用于细胞或组织抗原的检查，这是最简便、快速的方法，此法特异性强，常用于肾穿刺和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
㈡检查抗体方法 将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。
(indirect method ，又称sand wich method) ㈠二、间接方法 (indirect method ，又称sand wich method) ㈠ 检查抗体方法 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
2-1 免疫组织化学技术PPT课件
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
细胞免疫荧光技术-PPT课件
二，高背景
可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
三，细胞/组织的形态被破坏
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
必要时用恒温摇床摇洗
ห้องสมุดไป่ตู้
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
免疫荧光组织化学技术.doc
免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述二、免疫荧光组织化学的原理（一）直接方法1．检查抗原方法2．检查抗体方法（二）间接方法1．检查抗体夹心法方法2．检查抗体方法3．检查抗原法（三）补体法1．直接检查组织内免疫复合物方法2．间接检查组织内抗原方法（四）双重免疫荧光组织化学标记方法（五）对照试验1．直接方法2．间接方法3．补体方法三、荧光抗体的制备（一）荧光素1．异硫氰酸荧光素2．四甲基异硫氰酸罗达明3．得克萨斯红Texas red 4．其它荧光素（二）荧光素标记抗体的方法1．FITC标记抗体的方法2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法3．藻红蛋白标记抗体方法4．蓝色荧光素标记抗体方法（三）荧光抗体的质量控制1．染色特异性和敏感性的测定方法2．F/P比值的测定方法3．荧光抗体的保存四、免疫荧光组织化学染色方法（一）荧光抗体染色方法1．直接方法2．间接方法双层法3．间接方法夹心法4．补体方法5．膜抗原荧光抗体染色方法6．双重染色方法7．荧光抗体再染色方法（二）荧光抗原染色方法五、荧光显微镜检查方法（一）荧光和荧光显微镜（二）荧光显微镜标本制作要求1．载玻片2．盖玻片3．标本4．封裱剂5．镜油（三）使用荧光显微镜注意事项（四）荧光图像的记录方法六、非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的主要因素（二）消除非特异性染色的方法1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法2．DEAE纤维素柱层析法3．荧光抗体稀释法4．纯化抗原方法5．纯化抗体方法免疫吸收方法6．伊文氏蓝Evans blue衬染色方法七、现状与展望免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事1941建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞或组织化学。
它与葡萄球菌A蛋白SPA、生物素与卵白素、植物血凝素ConA等相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter FACS的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫荧光技术
免疫荧光技术在肿瘤治疗中的应用：通过检测肿瘤细胞表面的抗原，帮助医生制定个性化的治疗方 案
免疫荧光技术在传染病治疗中的应用：通过检测病原体表面的抗原，帮助医生制定针对性的治疗方 案
免疫荧光技术的 优缺点
优点
灵敏度高：能够检测到低浓度 的抗原或抗体
行标记
荧光信号的检测和成像
荧光信号的产生：通过荧光染料标记抗体或抗原，与靶标结合后产生荧 光信号
荧光信号的检测：使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行检测和定量分析
荧光信号的成像：通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行成像和分析，获得细胞或组织中靶标的分布和表达情况
荧光信号的定量分析：通过对荧光信号的检测和成像，对靶标进行定量 分析和评估，为科学研究和临床诊断提供依据。
蛋白质相互作用研究
免疫荧光技术 可以检测蛋白 质之间的相互
作用
免疫荧光技术 可以定量分析 蛋白质相互作 用的强度和动
力学
免疫荧光技术 可以研究蛋白 质相互作用的
机制和功能
免疫荧光技术 可以应用于药 物筛选和疾病
诊断
疾病诊断和治疗
免疫荧光技术在疾病诊断中的应用：通过检测细胞表面的抗原，帮助医生快速准确地诊断疾病
免疫荧光技术的 发展趋势和未来 展望
发展趋势
自动化：免பைடு நூலகம்荧光 技术将更加自动化， 提高检测效率和准 确性
多重检测：免疫荧 光技术将实现多重 检测，提高检测的 灵敏度和特异性
便携式：免疫荧光 技术将更加便携式 ，方便现场检测和 快速诊断
智能化：免疫荧光 技术将更加智能化 ，实现自动分析和 诊断
免疫荧光组织
免疫荧光组织（细胞）化学技术----基本原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。
用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。
1、直接法（1）检查抗原方法这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。
此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
（2）检查抗体方法将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。
2、间接法（1）检查抗体（夹心法）方法此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
（2）检查抗体方法用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。
此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
（3）检查抗原法此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1 抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液） 碳酸盐缓冲液为总量的1/10。 荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC
2 荧光素的种类：
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)
呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以 上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨 基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子
最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596～600nm 分子量：580KD
(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)
紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。
最大吸收光谱:550nm
最大发射光谱:620nm
二 荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；
必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1 具备用于标记抗体的荧光素条件
(1) 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未
结合的色素及其降解产物易排除。 (2) (3) (4) (5) (6) 荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 结合方法简便而快速，并且较稳定。 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
察到的上部不能充分激发光；细胞重叠或杂质掩盖易非特异着色。 (4) 封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在 pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓 冲液等量混合作封片剂（室温过夜，待气泡消失可使用)。
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml 混合加热溶解，5000g离心，15min，最后加入DABcos，终浓度2.5，溶解后，分装存 于-20℃中。
存档的HE染色标本： 褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学 的染色。
主要内容
一、荧光的特征
二、荧光素
三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
八、免疫荧光细胞化学的对照染色 九、激光扫描共聚焦显微镜
一、荧光的特征
结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。
5 膜抗原荧光抗体染色方法
原理和步骤：直接法或间接法； 适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细 胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 结果：阳性荧光主要在细胞膜上。
6 荧光抗体再染色法
荧光抗原染色法
抗原用荧光素标记，少用。
六、荧光显微镜检查方法
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则， 要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量 的吸收或释放。
激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能 级，这个过程叫激发。
发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化 成相应波长的光，这个过程叫发射。
(4) (5) (6) (7)
4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光 得克萨斯红（Texas red） 藻红素R 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1 Marsshall法
(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖 氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基， 一般最多能结合15～20个。
结果 黄绿色荧光处即阳性细胞分布部位。
3 补体法
用特异性抗体和补体混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗 体复合物上，再用荧光标记的抗补体的抗体与补体结合，从而形成抗原— 抗体—补体—抗补体荧光复合物。荧光显微镜下所见阳性荧光即为抗原所 在部位。 特点：很敏感，且不受特异性抗体种属的限制，适用于各种动物抗体的 检查方法。 方法： 1）涂片或冰冻切片固定，PBS水洗； 2）滴加免疫血清和补体等量混合液，37℃，30min； 3）PBS洗涤； 4）滴加抗补体荧光抗体37℃，30min； 5）水洗，缓冲甘油封固。 适用：肾穿刺组织活检诊断等；形态小的立克体、病毒颗粒或低浓度抗原。
最大吸收光谱：490～495nm， 最大发射光谱：520～530nm。 分子量：389.4KD
(2)四乙基罗达明(RB200)
褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性 条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。
（5）结果
荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。
2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一 些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自 身抗体和感染病人血清的检验。 缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。
荧光抗体的保存
0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； 加入防腐剂：硫柳汞或叠氮钠； 小量分装； 真空干燥后更易长期保存。
五、荧光抗体染色方法
适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法、补体法
1 直接法
（1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗 体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部 位呈现特异性荧光。 特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮 肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。 方法：如A抗原的抗体--- FITC 标记， B抗原的抗体--- RB200标记。 (1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)； 直接法进行染色反应。 (2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去； 再用FITC标记的A抗体染色； 按间接法进行。
第四章
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术
(immunofluorescence cytochemistry)
采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针， 检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧 光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本， 根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的 性质并定位，以及利用定量技术测定含量。
（2）器材
荧光显微镜，恒冷箱切片机，剪刀，镊子，载玻片。
（3）材料和试剂
FITC—sIg；0.01MPBS(Ph7.2)；100%丙酮；甘油缓冲液。
（4）操作步骤
1）恒冷箱切片，厚5μm，风吹干燥30min。 2）100％冷丙酮固定lOmin。 3）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。 4）滴加1：50—100的FITC—sIg，室温或37℃湿盒内染色30min。 5）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。 6）封片，镜检。 7）阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。
结合（标记）：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。 避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃ 透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃ 过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱 分离游离荧光素 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。
2 Chadwick法 3 改良法 4 透析标记法
荧光 (fluorescence)
跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重 激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短， 发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供 给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7～lO-8s)。
BP530-550 BP480-550
BA590
罗丹明
四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
IG
DM565
BP520-550
BA580IF
DM600
BP545-580
BA610IF
德克萨斯红：荧光抗体观察
2 标本制作要求
(1) 载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间（有时需石英玻璃载玻片) (2) 盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右（有时需干涉盖玻片) (3) 标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观
1 荧光显微镜
超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等 主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
（1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料 的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间 放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压， 此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。 （2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他中性 滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像 和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光 效应的前提和必要条件。