寡核苷酸的优化设计

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寡核苷酸的优化设计

寡核苷酸的优化设计作者：

郑仲承( 中国科学院上海生命科学院生物化学和细胞生物学研究所，上海 201931 ) 在核酸分子杂交、 DNA 序列测定和通过 PCR 放大 DNA 片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。

用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。

怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。

1. 估测可能形成的 DNA 或 RNA 双链的稳定性寡核苷酸，无论是 DNA 的或者 RNA 的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。

所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。

在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。

在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(G)来表示。

现在，大多采用 Breslauer 等人提出的，以最接近的相邻核

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苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。

为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。

此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：

此主题相关图片如下：

G(kcal/mol) 例如，双链 d(ACGG／ CCGT)的 G 是：

G(ACGG) ＝ G(AC) ＋ G(CG) ＋ G(GG) ＝－ (1.3 ＋ 3.6 ＋ 3.1) ＝－ 8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其 3末端会形成双链的引物的相容性。

也可以用来计算发夹环结构的 G。

不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。

如 3 个核苷酸时为 5.2 kcal/mol； 4 个时为 4.5； 5 个为4.4； 6 个是 4.3； 7 和 8 个为 4.1 kcal／ mo1。

2. 选择引物的一般规则设计和选择引物时有 5 个要素必需注意。

2.1 引物的 3末端不互补引物的 3末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。

有实验表明， 3末端双链的 G 是 0～－2 kcal/mol 时， PCR 产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6 时只有 40%，到－8 时少于 20%，而－10 时，接近于 0。

虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用 Taq 聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 很短的时间内就识别 3末端互补的双链区并发动聚合反应，即使 3末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。

2.2 引物分子内不互补应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的...

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