发酵工程第10讲

影响细胞破碎的主要因素是压力、温度和循环次数。
ln 1/(1–R)=KNPα R—破碎率，K—与温度有关的速度常数，N—操作压 力，α—与微生物种类有关的常数，P—循环次数
1.3 超声波法：是一种实验室内常用的细胞破碎方法， 由极为强烈的冲击波压力引起细胞破碎，超声波震荡 容易引起温度的剧烈上升，注意降温。超声波法处理 各种微生物的效果不同，一般杆菌好于球菌，G –好于 G+ 酵母的破碎效果较差。
剂：
硅藻土、珍珠岩粉、石英沙等。
2 去除高价无机离子 Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂的交换容量 2.1 用草酸去除钙离子，草酸钙还能促进蛋白质凝固
2.2 三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物
Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ 2.3 黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+
五
1 沉淀法
发酵产品的提取
沉淀法是分离和纯化生物物质和发酵产品过程最常用、 最简单的方法之一。是目前工业生产上广泛采用的方法。 1.1 盐析法：
1.1.1盐析法原理：盐析又称中性盐沉淀法，在发酵液中加
入中性盐破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电 荷，促进蛋白质或酶沉淀。
1.1.2 影响盐析的主要因素： a.蛋白质浓度：一般来说，高浓度的蛋白质溶液可以 减少盐的用量，低浓度的蛋白质溶液需要较多的盐， 常采用25%~30%的蛋白质浓度。
双水相萃取法是近年出现的很有价值的新型分离技术。 目前，已有数十种酶可用此法提取，此外，双水相萃 取法还可以分离核酸、生长素、病毒、干扰素、细胞 组织等。
双水相形成：绝大多数天然或合成的亲水性的聚合物 （如：聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇等）水溶液，在
与第二种亲水性聚合物或无机盐（K3PO4，MgSO4
2 非机械破碎法
2.1 酶溶法：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，
从而达到细胞破碎的目的。此法要注意选择适宜的酶 及酶系统，还要注意和其他方法复合应用。
2.2 化学渗透法：某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、
表面活性剂、抗生素、金属鳌合剂等可以改变细胞壁、 膜的通透性。
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细胞破碎率的测定： 直接测定法，测定蛋白质质量或酶活力，以及测定导 电率等。
成本的10%左右。
b. 如乙醇、有机酸、氨基酸、抗生素、维生素等。下游 成本占生产成本的30%左右，能耗占60%以上，下游投 资占整个工厂投资的60%左右。 c. 重组DNA产品、精制蛋白质产品。下游成本占生产成本 的80%~90%，而且这种偏向还有继续加剧的趋势。
2、下游加工过程的特点：
微生物发酵产品的品种很多，其下游加工过程一般有以
制备过程中。
3.1 离子交换树脂的原理：离子交换树脂可以分成两部 分：一部分是不能移动的高分子基团构成的三维空间
网状骨架，使树脂具有化学稳定的性质；另一部分是
可移动的离子，称为活性离子，它在树脂的骨架中进 出，就发生了离子的交换。 3.2 离子交换树脂的结构与分类：根据活性离子进行分 类，如果活性离子是阳离子，即这种树脂能与阳离子
结构简单、过滤面积大、形成的固形物水份低。缺点： 设备笨重、非生产的辅助时间长，卫生条件较差。 可过滤体积：V=n×a × b × c 为框内的长、宽、厚度。 V台=K×V 0.5~0.8）。 过滤后注意顶水! K为每台板框的压填系数（抗生素一般为： n为框数，a、b、c
传统板框压滤机
1- 尾板；2—滤框；3—滤板；4—主梁；5—头板；6—压紧装置
1.1 珠磨法：微生物细胞悬浮液与很细的研磨剂在搅拌 桨作用下快速搅拌或研磨，珠子之间以及珠子和细胞 之间互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放内含物。在 珠液分离器的作用下进行分离。
1.2 高压均质(匀浆）法：从高压室（几百个大气压）压 出的细胞悬浮液在高压下从阀室与阀杆之间的环隙高 速(450m/s)喷出，由于突然减压和高速冲击(撞击到 碰撞环)作用使细胞破碎。对于难以破碎、浓度高的细 胞悬浮液可采用多次循环操作。


全自动板框压滤机 油压机拉开板框，使板框到既定的距离，用滤框升 降架带着全部滤框下降到图位置，再启动滤饼推动 板，将滤框内的滤饼沿水平方向推出落下。在拉开 板框后，即可启动驱动装置牵引滤布循环行进，在 这过程中，有防止滤布歪斜装置自动调整，同时刷 洗滤布。
2 真空转鼓过滤机
1—转鼓
外滤面转鼓真空过滤机 2—过滤室 3—分配头 4—物料槽 5—搅拌器 6—喷嘴 10—刮刀
发生交换。就称为阳离子交换树脂。离子电离程度决
定树脂的酸性或碱性的强弱。
阳离子交换树脂是一类骨架上结合有磺酸（—SO3H） 或羧酸（—COOH），阴离子交换树脂骨架上结合有 伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基的聚合物。 3.2.1 强酸性阳离子树脂： R· SO3H R·SO3– + H+ 3.2.2 弱酸性阳离子树脂： R· COOH R· COO – + H+ 3.2.3 强碱性阳离子树脂：(含季胺基） R· NR3OH R· NR3 + + OH – 3.2.4 弱碱性阳离子树脂: R· NH2 + H2O R· NH3 + + OH –
物安全问题，防止菌体的扩散。
3、下游加工过程的一般操作流程
胞外产物
发酵液→预处理→细胞分离→细胞破碎→细胞碎片分离→提取
加热 过滤 离心 匀浆 研磨 溶胞 超声波 过滤 离心 （初步纯化 ） 吸附 萃取 沉淀 蒸馏
调 pH
絮凝
→精制→成品加工
（高度纯化） 层析 浓缩 离子交换 干燥
电泳 结晶 无菌过滤 包装
二、发酵液的预处理
1、过滤特性的改变
1.1降低液体黏度 1.1.1 加水稀释法：可降低液体黏度，降低产物浓度， 增加后续的处理量，应注意适量加水。 1.1.2 加热升温法：降低液体黏度，提高过滤效率，注
意对目的产物的影响。
1.1.3 降解法：发酵液中如含有多糖物质，最好用酶将 其转化成单糖，以提高过滤的效率。如万古霉素发酵
反胶束常用的表面活性剂有：AOT琥珀酸二酯磺酸钠， CTAB溴代十六烷基三甲铵，TOMAC氯化三辛基甲铵。 非极性的有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷。 3 离子交换：离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机
溶剂的固态高分子材料，能与发酵液中带电荷的物质
进行阴、阳离子交换。发酵生产上广泛用于抗生素、 氨基酸、有机酸等的提取与精制以及水处理和蛋白质
液过滤前加入0.025%的淀粉酶。
1.2 凝聚与絮凝 1.2.1 凝聚：加入某种电解质，在电解质异电离子的 作用下，胶粒的双电层电位降低，产生凝聚现象。凝 聚能力Al3+>Fe3+ >H + >Ca2+ >Mg2+ >K + >Na + 1.2.2 絮凝：絮凝是指在某些高分子絮凝剂的作用下，
基于桥架作用，使胶粒形成较大的絮凝团的过程。发
e.盐析的pH：盐析的pH选择以不降低酶的活力为原
则，可选择等电点的pH作为盐析的pH，一般要通过 试验选择产物稳定的pH范围进行盐析。
1.2 等电点法：等电点法主要用于一些两性电解质的产 物中，如抗生素、氨基酸以及水化程度不大或憎水性 的蛋白质如酪蛋白等，其优点是无需后续的脱盐操作。 1.3 有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等 水溶性的有机溶剂，有机溶剂分子能与大量的水分子
下游加工工程
一、微生物下游加工工程概论
1、下游加工过程在发酵生产中的地位 从微生物发酵液中分离、精制发酵产品的过程称为下
游加工过程（down stream process)。
下游加工的目标：高产、优质、低耗
按下游加工过程的难易程度，微生物的发酵产品可分 为三类：
a. 如啤酒、葡萄酒、各种发酵饮料等。下游成本占生产
结合，当其达到一定浓度时，蛋白质分子表面的水化
层被破坏，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静 电引力增大，从而凝聚和沉淀。一般来说，蛋白质的
Байду номын сангаас
相对分子质量越大，沉淀越易，所需加入的有机溶剂
量也越少。
2
萃取法：萃取指任意两相之间的传质过程。 广泛用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物 的提取。
2.1溶媒萃取法：溶媒萃取法比化学沉淀法分离程度高。
（ NH4 ) 2 SO4混合，并达到一定的浓度时，就会产生两 相。如：PEG4000 6.6% / 磷酸盐14% 体系，提 取人生长激素，hGH分配在上相，细胞碎片等在下相， 经过三级错流萃取，总收率达到81%。
2.3 反（逆）胶束（团）萃取法：当表面活性剂溶于水 中，并使其浓度超过临界胶团浓度CMC （Critical Micelle Concentration)时，表面活性剂就会在水溶 液中形成集聚体，称为正常胶束（normal micelle)。 反胶束(reversed micelle)是表面活性剂分散于连续 有机相中自发形成的纳米尺度的聚集体，具有热力学 稳定的系统。反胶束中有一个极性核心，被称之为 “水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的 水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合 作用进入“水池”，由于周围水层和极性基团的保护， 保持了蛋白质的天然构型，因而不会造成失活。
酵工业常用的是：聚丙烯酰胺类衍生物（用量 70mg/L)、天然有机高分子聚合物（明胶、海藻酸盐
等）、无机高分子聚合物（聚合铝盐、聚合铁盐）。
1.2.3 混凝：包括凝聚、絮凝的双重作用。 1.3 调整pH 调节发酵液的pH使之达到其等电点，可去除蛋白质等 两性物质。 1.4 加入助滤剂 在含有大量细小胶体粒子的发酵液中加入固体助滤剂， 助滤剂可作为细小胶体粒子的载体，均匀地分布于滤 饼层中，减小过滤的阻力。目前工业生产常用的助滤
下特点：
a. 成分复杂：发酵液是复杂的多相系统。含有细胞、代 谢产物和残留的培养基等。 b. 产品浓度低：传统发酵产物浓度仅酒精、柠檬酸、葡 萄糖酸在10%以上，一般在1%~10%，活性物质产品 为0.01 %~1%。
c. 收率较低：由于杂质多，产品质量要求高，多步操作。 d. 失活问题：生物活性物质通常很不稳定。遇热、有 机溶剂、某些金属离子等引起失活或分解。 e. 生物安全问题：对于某些基因工程产品，应注意生
适合固形物含量较大（>10%）的悬浮液的分离。工业 生产上适合霉菌发酵液的过滤分离。由于其推动力为
（真空度）的限制，其固相的干度不如压滤。
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叠片式离心机 属于沉降式的离心机， 是工业生产上应用最广 泛的离心机。一般用于 大规模的分离过程。
四
细胞的破碎
细胞的破碎分为：机械破碎法和非机械破碎法
1 机械破碎法
第十二章
发酵工程下游加工技术
上
原料 原料处理
游
培养基的配制、设计与灭菌
菌种的选育
保藏菌种
空气
种子制备
空气除菌 无菌空气
发酵培养
下
发酵液 预处理
游
精制加工 成品
初步纯化
工艺、设备、传统、现代
第十二章
一、下游加工工程概论
二、发酵液的预处理 三、发酵液的固液分离 四、细胞的破碎 五、发酵产品的提取 六、发酵产物的精制 七、成品的加工
b.盐析剂的种类：盐析效果好且常用的盐析剂有
(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO3等。 c.盐析剂的用量：盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类
和酶液中的杂质的性质、数量有关，应以收率最高的
用量为标准。具体用量需通过对比试验和生产实践摸 索才能得到。如：目前生产淀粉酶（BF7658）， (NH4)2SO4用量为40%，生产葡萄糖氧化酶， (NH4)2SO4用量为70%。 d.盐析的温度：盐析的温度选择以不降低酶的活力为 原则，可供选择的范围较大，一般是在常温下进行盐 析。
2.1.1 单级萃取：只用一个混合器和一个分离器的萃取
称为单级萃取。
2.1.2 多级错流萃取：由几个萃取器串联而成。 2.1.3 多级逆流萃取：料液与萃取剂分别两端加入。
2.2 双水相萃取法：溶媒萃取法难以用在蛋白质的分离 上，一方面许多的蛋白质都有极强的亲水性，不溶于 有机溶剂，另一方面蛋白质在有机溶剂相中易变性失 活。
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去除色素及其它物质
3.1色素产生 微生物生长代谢产生，培养基带来 3.2去除方法 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭（青霉素提取）等 吸附 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去 除非活性蛋白质
三 发酵液的固液分离
1 板框压滤机
比较适合固形物含量：1%~10%的悬浮液的分离。优点：