ELISA试剂盒
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ELISA 试剂盒
影响试剂盒质量的因素 试剂盒的选用 试剂盒的质检方法 目前试剂盒存在的问题
影响试剂盒质量的因素
1．原材料
(1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用 聚苯烯塑料微孔板，其对 ELISA 试剂盒的影响 在于孔间的显色差异。
(2)抗原 --自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。
纯 度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。
在实际工作中，其它实验室对某种试剂盒的实际 使用效果，往往具有很强的说服力。
综合的使用评价
对一种试剂盒的综合使用评价，是指多个实验室 对这种试盒实际应用效果的综合分析。
ELISA试剂盒的质检
1.包装、储存状态
内外包装、效期、试剂瓶是否漏液，真空包装 是否破损，试剂是否齐全等等
2.采用血清盘 (panel)质检
单克隆抗体 (单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇 的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心 ELISA 测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于 结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使 用一步法时“钩状”效应 (Hookeffect)的出现。因此， 在使用单抗建立双抗夹心 ELISA方法时，包被和指示抗 体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为 混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全 地结合待测物中的特异抗原。
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ELISA试剂盒的质检
3.采用弱阳性定值质控血清进行质检
对不同厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同 一弱阳性定值质控血清检测，可比较出不同厂 家或不同批号试剂盒的检测灵敏度 (测定下限 ) 的差异，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有 重要的参考价值。
F半乳糖甘酶
影响试剂盒质量的因素
(5)色原底物： HRP最常用的色原底物有邻苯二胺 (OPD)和四甲基联苯胺 (TMB) 。
邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底 物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm， 显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。
待测 抗原
酶标
E
抗体
E
E
底物
显色
固相 抗体
温育
E
E
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-一步法
待测 抗原
酶标
E
E
E
抗体
底物
显色
固相 抗体
E
E
E
E
洗板
温育
E
E
E
E E E
影响试剂盒质量的因素
3．试剂盒的运输和贮存
ELISA试剂盒的效期一般为 6个月，这是指 在贮存温度为 2～8oC的情况下，但一个 试剂盒从出厂至用户手中，均要经历运 输(如送检、检定、发货等)及运输中的贮 存，某一环节的不当，均会影响试剂盒 的临床使用质量。
试剂盒的选用
1．根据可能影响试剂盒质量的因素，从以下几 个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求 效期 固相材料的来源 包被抗体或抗原的性质 (单抗、多抗或合成多 肽或重组多肽 ) 显色底物 (是TMB还是 OPD) 测定模式(一步法或二步法 )
试剂盒的选用
2．同行对有关试剂盒的使用效果
个别的使用效果
+++ ++++ ++++ ++++
ELISA试剂盒的质检-TP
样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
17 +
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样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
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++++ +++ +++ +++ 38 +
+++ +++ ++++ +++
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++++ ++++ ++++ +++ 39 +
++++ +++ ++ +
27 +
++++
40 +
++ +++ ++++ +
28 + +++ +++++ ++++ ++++
29 +
影响试剂盒质量的因素
2．试剂盒的方法学设计 双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
待测 抗体
酶标
抗原
E
E
E
底物
显色
固相 抗原
洗板
洗板
E E
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
间接法测抗体（抗HCV、Tp)
待测 抗体
固相 抗原
洗板
E
E
E
酶标 抗体
底物
显色
洗板
E
EБайду номын сангаас
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-两步法
立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完 整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的 抗HCV 和抗 HIV抗体的检测有可能导致结合上 述决定簇的抗体漏检。
影响试剂盒质量的因素
(3)抗体
多克隆抗体 (多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定 簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次 制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。
四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处 有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的 A、B两种液 态试剂，即一定浓度双氧水溶液和 TMB。它们在溶液 中相对不稳定，因此在使用 ELISA试剂盒时，如底物 A·或／和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该 试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 ·
血清盘由一定数量的阴、阳性样本组成，可用 来判断试剂盒的灵敏度、特异性和符合率，如 HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盘。
ELISA试剂盒的质检-抗HCV
编号 结果 确认结果
编号 结果 确认结果
NS4 NS3 C
NS5
NS4 NS3 C
NS5
17 +
++
30 +
+
++ +++ +
18 +
+++
31 +
+/- ++
19 + ++++ +++ +++ ++ 32 +
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++ +++ +++ +++ 33 +
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+/-
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+++ ++++
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++ +++ +++ +
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+/- ++
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++++ ++++ +
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+++ ++++
+/-
24 +
影响试剂盒质量的因素
(4) 酶结合物 ELISA 试剂盒的核心部分，通常 ELISA 试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合 物的稳定性而定的。
辣根过氧化物酶 (HRP) ：易于提取，价格相对 低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与 抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。
碱性磷酸酶 (ALP)：碱性磷酸酶用于 ELISA必须 注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制 作用
影响试剂盒质量的因素 试剂盒的选用 试剂盒的质检方法 目前试剂盒存在的问题
影响试剂盒质量的因素
1．原材料
(1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用 聚苯烯塑料微孔板，其对 ELISA 试剂盒的影响 在于孔间的显色差异。
(2)抗原 --自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。
纯 度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。
在实际工作中，其它实验室对某种试剂盒的实际 使用效果，往往具有很强的说服力。
综合的使用评价
对一种试剂盒的综合使用评价，是指多个实验室 对这种试盒实际应用效果的综合分析。
ELISA试剂盒的质检
1.包装、储存状态
内外包装、效期、试剂瓶是否漏液，真空包装 是否破损，试剂是否齐全等等
2.采用血清盘 (panel)质检
单克隆抗体 (单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇 的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心 ELISA 测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于 结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使 用一步法时“钩状”效应 (Hookeffect)的出现。因此， 在使用单抗建立双抗夹心 ELISA方法时，包被和指示抗 体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为 混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全 地结合待测物中的特异抗原。
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ELISA试剂盒的质检
3.采用弱阳性定值质控血清进行质检
对不同厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同 一弱阳性定值质控血清检测，可比较出不同厂 家或不同批号试剂盒的检测灵敏度 (测定下限 ) 的差异，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有 重要的参考价值。
F半乳糖甘酶
影响试剂盒质量的因素
(5)色原底物： HRP最常用的色原底物有邻苯二胺 (OPD)和四甲基联苯胺 (TMB) 。
邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底 物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm， 显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。
待测 抗原
酶标
E
抗体
E
E
底物
显色
固相 抗体
温育
E
E
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-一步法
待测 抗原
酶标
E
E
E
抗体
底物
显色
固相 抗体
E
E
E
E
洗板
温育
E
E
E
E E E
影响试剂盒质量的因素
3．试剂盒的运输和贮存
ELISA试剂盒的效期一般为 6个月，这是指 在贮存温度为 2～8oC的情况下，但一个 试剂盒从出厂至用户手中，均要经历运 输(如送检、检定、发货等)及运输中的贮 存，某一环节的不当，均会影响试剂盒 的临床使用质量。
试剂盒的选用
1．根据可能影响试剂盒质量的因素，从以下几 个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求 效期 固相材料的来源 包被抗体或抗原的性质 (单抗、多抗或合成多 肽或重组多肽 ) 显色底物 (是TMB还是 OPD) 测定模式(一步法或二步法 )
试剂盒的选用
2．同行对有关试剂盒的使用效果
个别的使用效果
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ELISA试剂盒的质检-TP
样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
17 +
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样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
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+++ +++ ++++ +++
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影响试剂盒质量的因素
2．试剂盒的方法学设计 双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
待测 抗体
酶标
抗原
E
E
E
底物
显色
固相 抗原
洗板
洗板
E E
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
间接法测抗体（抗HCV、Tp)
待测 抗体
固相 抗原
洗板
E
E
E
酶标 抗体
底物
显色
洗板
E
EБайду номын сангаас
E
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-两步法
立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完 整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的 抗HCV 和抗 HIV抗体的检测有可能导致结合上 述决定簇的抗体漏检。
影响试剂盒质量的因素
(3)抗体
多克隆抗体 (多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定 簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次 制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。
四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处 有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的 A、B两种液 态试剂，即一定浓度双氧水溶液和 TMB。它们在溶液 中相对不稳定，因此在使用 ELISA试剂盒时，如底物 A·或／和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该 试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 ·
血清盘由一定数量的阴、阳性样本组成，可用 来判断试剂盒的灵敏度、特异性和符合率，如 HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盘。
ELISA试剂盒的质检-抗HCV
编号 结果 确认结果
编号 结果 确认结果
NS4 NS3 C
NS5
NS4 NS3 C
NS5
17 +
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影响试剂盒质量的因素
(4) 酶结合物 ELISA 试剂盒的核心部分，通常 ELISA 试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合 物的稳定性而定的。
辣根过氧化物酶 (HRP) ：易于提取，价格相对 低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与 抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。
碱性磷酸酶 (ALP)：碱性磷酸酶用于 ELISA必须 注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制 作用