BAC文库构建

(转载)BAC文库构建技巧
(2011-07-21 09:39:20)
基因组DNA文库构建实验技巧
基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。

通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。

一、分离基因组DNA（gDNA）
毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。

研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA
的纯度。

二、处理基因组DNA
根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。

不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。

比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。

构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA 片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。

构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。

需要注意：
（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。

用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。

（2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA 会显著降低克隆效率。

解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，
然后以此为参考定位所需的片段。

（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。

三、载体的选择
目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。

选用何种载体可以参考如下几个因素：
1．目标区域的大小
如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。

利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。

如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。

P1操作比较困难，PAC相对简便。

BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。

如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。

不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。

表1 各种载体的比较
2．筛选文库的难易程度
黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。

大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。

而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。

3.载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。

这个矛盾常常困扰着研究者。

而EPICENTRE’s CopyControlTM 克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。

CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。

单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。

四、将基因组DNA片段连接入载体
使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。

Epicentre的商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。

连接酶可以选用Epicentre Fast-Link DNA Ligase，连接快、效率高。

连接反应体系以100ul为宜。

注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。

脱盐可以用Epicentre推荐的Agarose Cone 方法，省时省力，防止DNA被剪切。

五、将重组载体转入宿主细胞
如果使用Epicentre试剂盒构建黏粒文库，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染Epicentre
EPI300-T1?Plating Strain。

挑出重组子，鉴定插入片段的大小。

如果文库的大小和质量都令人满意的话,
就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。

如果使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，应选择电转法，可以选择Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作为宿主，将上述连接产物转入细菌，涂板长出克隆后。

获得克隆，研究者需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。

Epicentre 文库构建试剂盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并电泳，可以方便的鉴定出BAC克隆的大小，从而估计出BAC
文库的大小。

如果文库大小合适，那么这个文库就可以进行后续的操作了。

六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。

一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段
大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。

举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC 克隆数为
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298
附记：关于基因组学的东西，偶要一点一点的加班加点的学习。