DNA序列在植物系统进化研究中的应用

收稿日期:2002-07-25.作者简介:石开明(1980-),男,硕士研究生,主要从事植物生化方面的研究.DNA 序列在植物系统进化研究中的应用石开明1,彭昌操1,彭振坤1,罗正荣2(1.湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;2.华中农业大学园艺林学学院,湖北武汉430070)摘要:DNA 序列分析已广泛应用于植物系统与进化学研究,根据不同的研究对象和问题选择相对应的DNA 序列来进行研究显得十分重要.目前在植物系统与进化学中主要一些DNA 的应用,主要是讨论叶绿体基因组(rbcL 等)和核基因组(18S ,ITS 等)中的特定DNA 序列区段.研究表明,18S ,rbcL 等编码基因一般适用于较高分类阶元甚至整个种子植物谱系间的系统发育的探讨,而ITS 及cpDNA 的非编码区序列等因其较快的进化速率多用于较低分类阶元的系统关系研究.关键词:DNA 序列;植物系统与进化;叶绿体基因组;核基因组中图分类号:Q523+·8 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2002)04-0005-06直到30年前,形态性状在进化和系统学研究中仍然占统治地位,但形态性状易受环境影响,普遍存在趋同和平行进化现象,使得许多分类群的进化地位难以确定.而DNA 序列则不同,它直接反映物种的基因型,并记录进化过程中发生的每一件事,含有极为丰富的进化信息.依据DNA 序列上的差异来比较植物的亲缘和演化关系,可以为植物系统与进化研究提供最直接的证据.随着PCR 和DNA 测序技术的产生和发展,分子数据为植物系统学研究提供了丰富而翔实的资料,成为解决系统与进化方面的一个十分重要的技术手段.植物基因组因其机构和功能上的差异,进化速率有所不同,基因组内,不同部分之间的序列变异速率也不同,这些都为不同分类阶元的系统发育提供了可供选择的多样化的性状来源.一般情况下,基因组内非编码区序列(包括内含子,基因间区)因其功能上的限制较少,比编码区表现出更快的进化速率(Curtris &Clegg ,1984;Palmer ,1991;Clegg et al .1994).研究中,人们首先将目光投向了叶绿体DNA ,其基因组较少且相对保守,单亲遗传.核基因组和叶绿体基因组的起源不同,二者可能有着不同的进化机制,核基因组的研究也逐渐引起人们的广泛重视.植物线粒体基因组进化速率不到叶绿体的1/3(W olf et al .1987),应用到植物系统进化研究中的范围比较窄.目前,对线粒体基因组研究的报道极少见到(Hiesel et al .1994;Pesole et al .1996),其有效的研究体系难以建立,因此本文将不予评述.Olmstead &Palmer (1994)强调,选择一个序列进行系统发育分析时,通常要考虑到以下问题:(1)这个序列要足够长,以提供足够的带有系统发育的核苷酸位点,且所选序列的差异百分率必须适于所要解决的系统问题.一般认为所比较的分类群间的序列差异率在5%～15%间最为合适,这时既可以使性状间的多次置换降至最低,又能提供足够数量的性状(Ritland &Clegg ,1990);(2)此序列必须易于排序,这对性状的同源性的正确评价是十分必要的:(3)此序列必须是直系同源(orthologous )的.用于系统发育分析的许多核基因存在一个严重的问题即区分直系同源(与生物体系统发育有关的基因)和异系同源(paralogous ,基因组内与基因重复有关的基因)(Sanderson &Doyle ,1991:Doyle ,1992);叶绿体不存在这个问题,只要基因保留在叶绿体基因组内,所有的基因均为单拷贝.1　叶绿体基因组(cpDNA )大多数叶绿体基因组具有相似的结构,为闭环双链DNA .叶绿体DNA 总量约占植物总DNA 的10%～20%,长度多在120～160kb 之间,其长度变异主要由2个反向重复系列(IR )引起.这2个反向重复序列长约第20卷第4期2002年12月湖北民族学院学报(自然科学版)J ournal of Hubei Ins titute for Nationalities (Natural Science Edition )Vol .20　No .4Dec .2002图1　高等植物叶绿体DNA 结构示意图Fig .1　DNA structure of chloropast of higher plants IR :反向重复区,包括编码rD NA 的基因,LSC :大的单拷贝区,SSC :小的单拷贝区22～25kb ,将整个cpDNA 分为一个大单拷贝区(LSC )和一个小单拷贝区(SSC )(如图1).迄今为止,叶绿体DNA 序列分析为植物系统学研究提供了大量信息,这是因为:(1)基因组较小,但包含大量的DNA 成分;(2)在分子水平上的差异明显,为比较进化研究提供了大量的基本的信息支持;(3)叶绿体DNA 无论在序列还是在结构上都相当保守,因而保证了类群间的可比性.目前,已有水稻(O ryza sativa )(Hiratsuka et al .1989)、玉米Zea mays (Maier 1995)、烟草(Nicotiana tabacum )(Shinozaki et al .1994)、一种列当科植物Epifagus virginiana(Wolfe et al .1992))、一种绿藻(Nephroselmis olivac ea )(Turmel ,et al .1999)等物种的全部叶绿体DNA 序列被测定,许多重要的叶绿体基因如rbcL 、psbA 、trank 、rpo 、atpB 等已被克隆与测定,这使得对叶绿体DNA 的序列分析显得十分方便.1.1　rbcL 基因rbcL 基因编码1,5-二磷酸核酮羧化酶/氧化酶大亚基,该酶催化光合作用中的C O 2的固定.由于该酶的重要性使rbcL 成为研究的重点对象.1977年,Coen 首先测定了玉米的rbcL 序列,1987年,Ritlandh 和Clegg Zura wski 和Clegg 首先提出rbcL 基因是用于系统发育研究的合适的基因位点.随着对rbcL 基因研究的深入,如结构和功能(Kellogg &Juliano ,1997)、进化速率(Bousquet et al .1992)及其在植物不同分类阶元中的系统学意义(Kellogg &Juliano ,1997)等等,rbcL 成为分子系统学研究中应用最普遍的基因之一.虽然rbcL 基因在不同植物类群中的进化速率有着较大的差异(Bousquet et al .1992),但总的来说相对保守(如烟草和水稻的rbcL 基因的核苷酸相似性为93%),为植物较高分类阶元的系统发育历史的重建研究提供了一重要的性状来源,并得到了很好的启发性的研究结果.迄今为止,rbcL 基因序列已用于许多分类群的系统发育研究,从科内(多位远缘属间)(如Xiang et al .1993;Fay &Chase ,1996;Morton et al .1997;Richardson et al .2000;Schwarzbach &Ricklefs ,2000)到有花植物主要谱系间(Olmstead et al .,1992),甚至整个厥类(Hasebe et al .1995)、种子植物谱系间的关系(Chase et al .1993).与进化速率快的基因相比,rbcL 基因与其它进化较慢的cpDNA 序列常被广泛应用于较远类群的系统学研究中,但用DNA 序列研究远缘相关类群常会遇到以下两个问题(Olmstead &Palmer ,1994):(1)所选编码序列的各核苷酸位点的替代速率不一致.如rbcL 基因的同义替代率比非同义替代率大约高15倍,但这一缺陷可以使DNA 序列翻译成蛋白,进而比较氨基酸序列的方法予以弥补(表1);(2)在主要植物分支间关系的研究中,许多关键问题常会涉及到早期植物在较短的时间里发生了怎样的变化,而进化慢的基因对于进化快的基因在分化时期未能发生足够的碱基替代,故对所发生的分支进化不能提供足够的重建信息,但将分子与形态数据结合起来分析,会对系统重建有所帮助.1.2　其它叶绿体(cpDNA )基因目前,除rbcL 基因外,越来越多的cpDNA 编码基因(如matK ,ndhF ,atpB 等)被广泛应用于不同科、目乃至整个被子植物的系统发育研究中.matK 基因的进化速率大约是rbcL 的2～3倍(Crayn ,1998;Gadek et al .2000),ndhF 基因的核苷酸替代速率约是rbcL 的2倍(Suguira ,1989;Wolfe ,1991;表1).在某些类群中,这两种基因能够更好地提供系统发育信息,解决系统关系.atpB 序列与rbcL 基因的进化速率非常相似,其许多特性使其在较高分类阶元的系统关系研究中具有一定的价值,其长度为1497kb ,既容易被测序,又可以提供足够的潜在系统发育信息(Sc otland et al .1995;Smith &Carr oll ,1997;Prather et al .2000).非编码区序列的测定在植物不同层次系统学研究中也越来越受到重视(Small et al .1998),该区包括内含子(rpl16,rps16,rpoC1)和间隔区(trnL -F 和trnT -L ).与许多编码基因相比,这些非编码区因其在功能上的限制较少,表现出更快的进化速率;与相当长度的编码区片段相比,这些非编码区能提供更好的具系统学意义的信息位点,故多用于较低分类阶元及其分化类群间的系统学研究中(Clegg et al .1994;Downie et al .2000).虽然在植物系统学研究中目前该区积累的分子数据还不是非常多,但是其应用潜力却不容忽视.6湖北民族学院学报(自然科学版)第20卷表1　适用于系统学研究的叶绿体基因Tab .1　Chloroplast genes for phylogenetic studyGeneLen gth 1%AA Si m 2Ko 3Substitution rate K A 4K S 516s rRNA14899763Na Na 23s rRNA28109464Na Na psb A10629911145psbD10629812149psaB22059712151psbB152********psbC14229712148psaA22539613252rbcL14349317463atpB14979218462ndhA11828919671atpA152********ndhD153********rpoB32138118951rpoCI 7204678241269ndhA 7109576251075rpoA101469271862ndh F213367311976rpoC2416764261761mat K (orfK )153059372682 ＊引自Ol mstead &Pal mer ,1994;From Olmstead &Palmer ,19941.烟草中的碱基对数目(含终止含子);In base pass épairs in tobacco including termination cordon .2.烟草与水稻相比;Bet ween tobacco and rice .3.总核苷酸替代率(烟草与水稻相比);Overall nucleotide s ubs tit ution rate ,based on comparis on of rice and tobacco .4.非同义替代率;No synonymous nu -cl eotide s ubstitution rate .5.同义替代率;Synonymous nucleotide substituti on rate .6.核苷酸相似性百分比;Percent nucleotide si milarit y .7.含一大的内含子;Contains single large intone .2　核基因组(nDNA )核基因组结构又大又复杂,核叶绿体基因组相比相差甚远.由于它太大和太复杂,且包括许多重复的和非编码的序列,使得对其不可能进行限制性位点图谱分析.限制性片段长度多态性分析(RLFPs )表明随机核探针应用于系统发育研究中有许多缺点.大部分核基因中存在种源(orthologous )(来源于物种形成)和基源(paralogous )(来源于基因重复)拷贝,使得核基因的应用复杂化.尽管对核基因进行比较研究非常困难,但基因组中编码核糖体RNA 的重复区(nrDNA )却是一个可以进行比较研究的片段.nrDNA 由含nrR NA 基因的非编码间隔区DNA 的串联重复片段组成,并且表现出足够快的一致进化(concerted evolution ),以至于在大多数情况下,可把它看成长度相当的cpDNA 片段来分析(Zimmer et al .1980,Arnheim 1983,Hmby &Zimmer 1992).目前对核基因组序列的应用也主要集中在核核糖体DNA (nrDNA )上.高等植物核核糖体DNA (nrDNA )的每个重复单位从5端开始,包括外转录间隔区(external transcribed spacer ,简称ETS )、18S 基因、第一内转录间隔区(internal transcribed spacer1,简称ITS1)、5.8S 基因、第二内转录间隔区(ITS2)和26S 基因,重复单位之间为基因间隔区(intergenic soacer ,简称I GS )称为非编码区(non -tran -scribed spacer ,NTS ).nrDNA 的编码区序列(18S 、5.8S 和26S 基因)选择压大,属高度保守区.非编码区序列(如I GS ,NTS )是高变区,选择压小得多,序列差异主要表现在该区上.而ITS 区是中度保守区,序列的变异度处于两者之间.nrDNA 的这些特点可为系统发育研究提供广谱信息.高度保守的编码区序列(18S 、5.8S 和26S )主要用于种、属以上分类层次的系统学研究中,中度保守的重复序列(如上述的ITS1和ITS2)比较适合于种以下和种间关系的研究,而非编码区序列(ETS 、I GS 、NTS )则在近缘类群间的系统学研究、杂交研究及居群进化学研究上具有一定的应用潜力(Hillis &Dixon ,1991).2.1　ITS (内转录间隔区)18S ～26S 核核糖体DNA (nr DNA )的内转录间隔区ITS 被5.8S 分为ITS1和ITS2两部分.I TS 区在植物核7　第4期石开明等:DNA 序列在植物系统进化研究中的应用8湖北民族学院学报(自然科学版)第20卷基因组中是高度重复的.全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandem repeats)方式出现在一个或多个染色体基因位点上(Regers&Bendich1987,综述见Ha mby&Zimmer1992).这样的多拷贝有利于发现、克隆和测序.这些特征加快了ITS区在植物系统学中的应用.ITS序列在裸子植物中变异很大,尤其是长度变异非常显著,因此一般认为I TS不适用于裸子植物的系统发育研究(汪小全和洪德元,1997).但在被子植物中,ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性,说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序,而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如属间、种间)解决植物系统发育问题.屈良鹄和陈月琴(1999)通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出:被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2%～10.2%,属间差异值为9.6%～28.8%,这对系统发育研究来说都是较合适的范围.另外,ITS在一些起源古老(Vburnum、Nothofagus及Winterceae的一些属)或世代较长的植物类群(如木本竹子)中的变异较低(Baldwin et al.1995;Hodkinson et al.2000;Guo et al.2001),也为研究那些间隔区进化速度很慢的古老类群间的关系和长世代类群内较高阶元的系统重建提供了可能性.通常,ITS在研究属内种间和较近的族间、属间关系时都表现出较高的趋异率和信息位点百分率,为类群内部的系统重建提供了较好的支持(如:Baum et al.1998;Downie et al.2000a;Schwarzbach&Ricklefs,2000;Stanford et al.2000;Xiang et al.1998);另外,ITS序列对于揭示异域或间断分布居群间的关系也具有潜力(Baldwin,1993;Widmer&Baltisberger,1999).2.2　其它核核糖体(nrDNA)序列18S基因保守性强,进化速率比rbcL还要慢3倍,一般用于高级阶元的系统研究,其序列变异程度尤其适于探讨被子植物乃至种子植物内部的深度系统分枝间的关系.E TS及I GS由于难以找到合适的通用引物扩增整个区域,在系统学研究中的例子比较少,此外,nrDNA的非编码区NTS的应用也极少见到.3　结束语在植物系统与进化学研究中,根据不同等级的分类群来选择DNA序列需要充分考虑到该序列变异度能否为比较研究带来足够的进化信息.若进化太快,则序列不适合研究较古老或较高的分类群,因为它的变异已饱和而不能提供有用的信息.相反太保守则不适合于研究较进化或较低的类群,因为其变异积累不够,各类群几乎难以区别.因此,根据特定的对象和问题进行系统与进化学研究时,关键是要选择与之相对应的合适的DNA序列区段.而且,选择的DNA序列最好是单拷贝基因.这有两个优点:一是单拷贝基因在不同种间是直源的而不可能是并源的.并源基因会混淆物种的进化关系,二是单拷贝的种间多态性低.应该注意的是,用DNA序列研究系统进化时也存在许多问题.首先,虽然同一DNA序列在不同分类群间的进化速率有所差异,但序列本身在植物系统学的研究中总有一相对稳定的适用范围,这使得其涵盖的研究内容和层次有限.其次,分子片段也仅仅是分类群诸多性状的一个来源,它虽能为分类群的系统重建提供不可忽视的信息,但也并不能完全地反映其真实地演化历史.此外,分子序列的同源性确定在实际应用中又是一个十分复杂的问题.除某些小分子和单拷贝DNA外,分子性状的同源关系比形态性状复杂得多,这些复杂性使得人们无法确定序列间的同源关系,从而在进行系统分析时困难重重.因此,应该重视将多个不同来源或不同功能的适用DNA相互结合起来分析(例如,可以用双亲遗传的r DNA来验证用母系遗传的cpDNA 得到的结果),此外,还可以结合形态学、细胞学和化石记录方面的证据从多角度来分析,以获得更多的比较信息,使分析结果更接近系统发育历史.参考文献:[1]陈之端,冯昱.植物系统学进展[M].北京:科学出版社,1998.[2]林忠平.走向21世纪的植物分子生物学[M].北京:科学出版社,2000.[3]黄原.分子系统学原理、方法及应用[M].北京:中国农业出版社,1996.[4]邹喻苹,葛颂,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京:科学出版社,2001.[5]孟少武.基于5.8SrD NA序列论三白草科的系统发育[J].云南植物研究,2001,23(3):309～312.[6]汪小全,洪德元.植物分子系统与进化近五年的研究进展情况[J].植物分类学报,1997,35(5):465～480.[7]王建波.核rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用[J].植物分类学报,1999,37(4):407～416.[8]Arnhei m N.Concerted evolution of multigene families.Evoluti on of genes and proteins[J].Sinauer,Sunderl and,MA.1983:38～61.[9]Baldwin B G.Molecuar phylogenetics of Calycadenia(Compositae)based on ITS s equences of nuclear ri bosomal DN A:Chromoso mal and morphol ogical evolu-tion reexamined [J ].A mer J Bot ,1993,80:222～238.[10]Baldwin B G ,Sanderson M J ,Porter J M ,et al .The ITS region of nuclear riboso mal DN A :A val uable source of evidence on angiosperm phylogeny [J ].Ann Miss ouri Bot Gard ,1995,82:247～257.[11]Baum D A ,Small R L ,Wendel J F .Biogeography and floral 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