定量蛋白质组学研究技术.共42页
CN7 定量蛋白质组学
定量策 略 建立在2 DE基础之上的染料染色法 建立在2-DE基础之上的染料染色法
通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。 通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。 在这个过程中，理想的染色方法必须具备以下几点： 在这个过程中，理想的染色方法必须具备以下几点： 1.具有良好的线性范围 1.具有良好的线性范围 3.具有高的灵敏度 3.具有高的灵敏度 缺点： 缺点： 2-DE不能检测出具极端等电点 分子量太大的、 不能检测出具极端等电点、 1. 2-DE不能检测出具极端等电点、分子量太大的、太小 低丰度的蛋白质及膜蛋白； 的、低丰度的蛋白质及膜蛋白； 2-DE分离效果不绝对 分离效果不绝对， 2. 2-DE分离效果不绝对，许多单一的蛋白质点包含了一 个以上的蛋白质。 个以上的蛋白质。 2.具有良好的通用性 2.具有良好的通用性 4.染色不影响后续的鉴定过程 4.染色不影响后续的鉴定过程
每结合一个 15N ， 该肽比正常 14N 的相同肽 大一个质量单位， 大一个质量单位，使得不同细胞状态来源的肽 段得以区分，肽质谱峰信号成对出现， 段得以区分，肽质谱峰信号成对出现，从而根 据质谱峰的信号强度来进行准确的定量。 据质谱峰的信号强度来进行准确的定量。 缺点： 缺点：由于相同肽段的不同同位素标记形 式之间的质量变化依赖于氮原子数目， 式之间的质量变化依赖于氮原子数目，因此对 未知蛋白难以进行定量。 未知蛋白难以进行定量。
二、同位素亲和标签技术
此法由Gygi 1999年提出 年提出。 此法由Gygi 等1999年提出。 ICAT试剂包括三部分 ： 反应基团， ICAT 试剂包括三部分： 1. 反应基团 ， 可特异地 试剂包括三部分 与蛋白质侧链上的半胱氨酸（ Cys） 残基的-SH进行 与蛋白质侧链上的半胱氨酸 （ Cys ） 残基的 -SH 进行 反应， 使试剂共价结合在蛋白质侧链上； 反应 ， 使试剂共价结合在蛋白质侧链上 ； 2. 同位素 标记的接头， 含有稳定同位素（ 的标记； 标记的接头 ， 含有稳定同位素 （ H 和 D ） 的标记 ； 3. 亲和标记的生物素， 用于分离标记的蛋白质或多肽。 亲和标记的生物素 ， 用于分离标记的蛋白质或多肽 。 ICAT试剂中 位置被H 取代时， ICAT 试剂中 8 个 X 位置被 H 取代时 ， 称为轻试剂 位置被D取代时，称为重试剂（ （D0），8个X位置被D取代时，称为重试剂（D8）。 轻试剂和重试剂的相对分子量差8Da或 Da（ 轻试剂和重试剂的相对分子量差 8Da 或 4Da （ 肽段带 两个电荷） 两个电荷）
定量蛋白质组学研究技术
细胞工程教研室
四 针对性亲和标签技术
磷酸化蛋白质同位素标识亲和标签
➢ PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上旳研 究和鉴定磷酸化蛋白质磷酸化位点旳新措施， 且对低丰度蛋白质旳鉴定有效。
➢ PHIAT试剂具有亲核旳巯基和同位素标签及 其共价结合旳生物素基团。
➢ 利用此措施已成功鉴定了酪蛋白和酵母提取 物旳磷酸化位点。
经 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标识必需氨基酸亲和 肽段旳N末端。因为肽段旳乙酰化位点 不一，被标识旳重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
➢ 每一种试剂都涉及三部分：一种报告基 团（分子量分别为114u、115u、116u 和117u）、一种平衡基团（分子量分别 为31u、 30u、29u和28u）和一种与 肽段反应旳基团。
➢ 当我们需要同步比较四组不一样品时， 样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后 混合在一起做质谱鉴定。
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♣ 可裂解同位素标识亲和标签
✓ 用13C/12C替代了2H/1H ✓ 使用了酸裂解连接子 ✓ 不同肽段质量相差9u或9u旳倍数 ✓ 亲和标签试剂由3部分构成
• 半胱氨酸特异性反应基团 • 含9个同位素13C或12C标签旳可裂解连接子 • 亲和纯化生物素
定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组学技术随着科技的发展，科学家们逐渐掌握了理解生物组成和生物学过程的能力。
其中最有前景的技术之一就是定量蛋白质组学技术。
那么什么是定量蛋白质组学技术呢？本文将围绕这一问题来介绍这项技术。
一、什么是定量蛋白质组学技术？定量蛋白质组学技术是利用高通量质谱技术分离和分析细胞或组织中存在的蛋白质，同时识别这些蛋白质在不同生物学状态下的表达变化。
通俗地说，它是一种通过观察和比较蛋白质在不同状态下的表达程度，得出蛋白质的功能和进一步的研究方向。
二、定量蛋白质组学技术的实现步骤（1）样本收集和制备首先需要准备样本，样品的采集和样品制备是定量蛋白质组学技术中非常关键的步骤。
正确的样品制备可以确保得到的蛋白质质量和数量的准确性。
这一步骤要求科学家考虑到实验设计、样品提取、洗涤和分离蛋白质的方法等多种因素，以进行比较有价值的定量蛋白质组学分析。
（2）蛋白质的消解和分离在样品制备之后，需要进行蛋白质消解和分离。
消解和分离需要先对蛋白质进行断裂和分离，这可以通过多种不同的方法完成，包括化学方法和生物物理学方法。
（3）质谱分离和检测在进行蛋白质的消解和分离后，需要将其转化为质谱可探测的形式。
这可以通过液相色谱与质谱联用，通过对洗脱色谱的样品进行质谱分离和检测，最后得到蛋白质中的定量信息。
（4）数据分析最后，科学家需要利用数据分析方法来获取蛋白质在细胞或组织中不同生物学状态下的表达变化数据。
这包括统计学分析、峰检测、数据可视化等方法。
三、应用领域定量蛋白质组学技术的应用领域广泛。
它在癌症、心血管疾病、肾脏病、神经疾病和生理学等多个学科领域都有应用。
例如，有研究表明，通过定量蛋白质组学技术可以研究药物作用机制、生物标志物和药物靶标。
在精神类疾病方面，也有相关研究表明，在慢性使用大麻后，定量蛋白质组学技术可以检测出相关蛋白质的变化，这些变化与记忆和认知功能的损害有关。
总的来说，定量蛋白质组学技术在许多生物学和医学领域都有广泛应用，可以帮助科学家更好地了解细胞和组织的生物学功能和疾病发展机制，并为开发新药和治疗方案提供更精细的信息。
定量蛋白质组学LC-MS-MS
百泰派克生物科技
定量蛋白质组学LC-MS-MS
定量蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，这个概念的提出使蛋白质组学的研究内容从定性向精确含量鉴定方向进一步发展。
目前，常用的蛋白质组学定量技术是基于质谱的技术，根据其是否使用同位素标记又分为标记策略（Label）和非标
记策略（Label Free），标记策略如TMT、iTRAQ和SILAC等。
LC-MS-MS即液相色
谱-串联质谱技术，是各种蛋白质质谱定量技术中所不可缺少的分析技术，也是实
现蛋白质定量的关键步骤。
其将经过不同标记或处理得到的蛋白肽段利用液相色谱进行分离后再进行多级质谱分析，根据肽段离子的质谱信号如离子峰强度等结合生物信息学分析手段计算各肽段的含量，从而实现整个蛋白质的含量鉴定。
百泰派克生物科技采用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，提供高效精准的定量蛋白质组学LC-MS-MS服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析。
定量蛋白质组学
Amersham 2D-DIGE
第二节
运用质谱进行定量的蛋白质 组分析技木
一.稳定同位素代谢标记技术 该方法由Oda提出,其具体作法是，如在 两组酵母细胞平行生长的培养基中，一组含 有天然氮同位素组分(14N，99.6％；15N，0.4 ％)；另一组基质相同，但富含15N(＞96％)。 经过一段时间培养后,将细胞裂解，然后将这 两组蛋白质等量混合，通过凝胶电泳分离和 染色后，找出差异表达蛋白质，将其从凝胶 中挖出，酶解后，用MAIDI-TOF分析。
Analyze peptide peak ratios
5. MS/MS
Obtain sequence info
Examples of Real Data using ICAT
MS
MS/MS
优点：ICAT具有广泛的兼容性
主要表现在： 第一.能够兼容分析任何条件下体液、细胞 组织中绝大部分蛋白质； 第二.烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂 (如尿素、盐酸胍等)存在下都可进行； 第三.只需分析含cys残基的肽段，从而降低 了蛋白混合物分析的复杂性； 第四.允许任何类型的生化、免疫、物理的分 离法．因此能很好地定量分析微量蛋白质。
新的技术 1.荧光染色（标记）技术与考马斯亮蓝染色
法或银染法相比，能更好满足于上述几点
要求，从而能够应用于定量蛋白质组学研究 2.稳定同位素代谢标记的方法和同位素亲和 标签技术巧妙解决了质谱仪不能应用于对 蛋白质点的定量分析的缺点
第一节 利用荧光染料进行 定量的蛋白质组分析技术 适用于检测蛋自质的荧光染料有两类: 一种类是用于蛋白质荧光染色，如Sypro Ruby 和 RuBS 另一类用于蛋白质的荧光标记，如Cy2,Cy3和 Cy5,可进行荧光双向差示凝胶电泳。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一，可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前，蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理，使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测（MRM）、定量蛋白质鉴定（iTRAQ）和标记蛋白质鉴定（TMT）等。
多重反应监测（MRM）是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆（triple quadrupole）进行分析。
首先，确定待测蛋白质的肽段序列，然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来，使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析，测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后，通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算，得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定（iTRAQ）是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中，待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后，将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量，通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度，可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定（TMT）是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中，多个待测样品用不同的同位素标记，然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法，定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹（Western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）等。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学是一门研究蛋白质组含量及其变化的学科。
百泰派克生物科技提供基于质谱的定量蛋白组分析服务。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学，就是对一个基因组表达的全部蛋白质或者一个复杂混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量与鉴定。
定量蛋白组学是蛋白质组学研究的一个重要分支。
蛋白质的表达水平与生命活动息息相关，因此对蛋白质进行定量分析对阐明蛋白质的生物学功能和细胞的各种生物进程十分重要。
定量蛋白质组学研究技术
现在常用的蛋白质组定量的方法根据定量手段的不同可以分为荧光定量技术、蛋白质芯片技术和基于质谱的定量技术。
荧光定量技术是二维凝胶电泳技术与荧光染色技术相结合的一种技术，运用荧光染料标记蛋白质，在2D胶上进行分离和鉴定，按照荧光强度差异来比较蛋白量的变化。
蛋白质芯片技术是通过蛋白质芯片从待测样品中捕获配体后，利用激光共聚焦显微镜或质谱等检测技术进行蛋白质组定量分析的。
基于质谱的蛋白组定量技术通过比较具有相同离子化能力的蛋白或多肽的质谱峰强弱，可以对它们进行相对定量。
相对于其他技术，该技术不仅可以测定肽序列，而且可以准确定量蛋白质。
目前基于质谱的定量蛋白质组学技术主要分为标记（Label）和非标记的（Label Free）两大类，其中标记的又可分为体内标记（如SILAC标记）以及体外标记（如 iTRAQ、TMT 标记）。
定量蛋白质组学。
第4章-蛋白质组学中的定量研究技术
Chapter IVChapter IV Quantitative Research Quantitative ResearchTechniquesTechniquesin Proteomicsin ProteomicsNorthern blot of TgMTP1 expression in hyperaccumulatorh bl f i i h land nonaccumulator species.T t l i l t d f h t f th h l t T i d thTotal RNA was isolated from shoots of the hyperaccumulator T. goesingense and the nonaccumulators A. thaliana, T. arvense, and B. juncea after exposure to Ni for 48 h. Northern blots equally loaded with 30 mg of total RNA were probed with TgMTP1t1, stripped, and reprobed with TgMTP1t2 and finally stripped and reprobed with an A.pp,p g,y pp pthaliana actin probe as an RNA loading control.Persans et al, 2001, PNASQuantitative Proteomics(定量蛋白质组学)•定量蛋白质组学（Quantitative Proteomics），就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体把个基因组表达的全部蛋白质或个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确的定量与鉴定的一门学科。
•基于研究手段的不同，定量蛋白质组学研究技术可分为三类：为三类荧光定量蛋白质分析技术蛋基于质谱的蛋白质组定量分析技术蛋白质芯片技术荧光定量蛋白质分析技术Fluorescence Quantitative Protein AnalysisTechniques•与蛋白质共价结合的荧光染料由于染料与蛋白质的结合是多位点的，对蛋白质的溶解度有一定影响。
定量蛋白质组学研究技术
定量蛋白质组学研究技术定量蛋白质组学研究技术是一种基于质谱技术，通过分析蛋白质组学中的定量变化，来研究细胞、组织或生物体内蛋白质表达的数量变化。
这种技术可以用于诊断疾病、评估治疗效果、揭示蛋白质功能等方面的研究。
本文将介绍定量蛋白质组学研究技术的原理、方法和应用。
定量蛋白质组学研究技术的原理是通过质谱仪来定量分析蛋白质样品中的各个蛋白质的相对或绝对数量。
常用的定量方法有定量蛋白谱法（QuantiSpectrum）、定量蛋白同位素标记法（SILAC）、定量蛋白肽标记法（iTRAQ）和定量蛋白质异位素标记法（TMT）等。
定量蛋白谱法是通过比较不同实验组样品中的质谱图峰强度来确定蛋白质的数量变化。
它可以分别应用于肿瘤细胞研究、生物标志物发现等方面。
SILAC是一种利用同位素标记技术来定量蛋白质的方法。
在该方法中，通过在不同实验组中添加不同重量比的同位素标记的氨基酸（通常是L-谷氨酰-[U-13C6，U-15N2]丙氨酸），然后进行蛋白质提取、消化、质谱分析。
通过比较同位素标记蛋白质和未标记蛋白质的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
iTRAQ是一种通过修饰蛋白质消化产物来定量蛋白质的方法。
在iTRAQ实验中，将不同实验组的蛋白质消化产物用不同的寡肽修饰标记物标记，然后混合，并进行液相色谱-质谱分析。
通过比较同位素标记的寡肽的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
TMT也是一种利用同位素标记技术来定量蛋白质的方法。
在TMT实验中，将不同实验组的蛋白质消化产物用不同的同位素标记物标记，然后混合，并进行液相色谱-质谱分析。
通过比较同位素标记的蛋白质肽段的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
定量蛋白质组学研究技术在医学、生物学和蛋白质化学等领域有广泛的应用。
例如，在临床医学中，可以用定量蛋白质组学研究技术来寻找患者体内具有预后价值的蛋白质标志物，以辅助诊断、预测疾病进展和评估治疗效果。
在生物科学研究中，可以用定量蛋白质组学研究技术来揭示细胞信号转导通路、细胞功能调控机制等方面的问题。
蛋白质组学定量研究常见方法
蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究是通过测定蛋白质样本中蛋白质的相对或绝对含量来了解生物系统中蛋白质表达的变化。
在蛋白质组学定量研究中，有很多常见的方法，包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
以下将对其中几种常见方法进行介绍。
1.质谱法质谱法是蛋白质组学定量研究中应用最广泛的方法之一、质谱法可以利用质量比较准确测定蛋白质的绝对或相对含量。
常见的质谱方法包括二维凝胶电泳质谱法（2D-DIGE）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和同位素标记质谱法（SILAC），通过这些方法，可以高效准确地测定蛋白质的绝对或相对表达水平。
2.免疫学法免疫学法是一种广泛使用的定量蛋白质组学方法，其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过与荧光或酶标记结合进行测定。
常见的免疫学方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术和蛋白质芯片技术等。
这些方法具有高灵敏度和高特异性，可以快速准确地测定蛋白质的表达水平。
3.色谱法色谱法是一种常见的蛋白质组学定量方法，通过色谱柱的分离和去除杂质，从而获得纯净的蛋白质。
色谱法可以分为离子交换色谱、逆向相色谱、尺寸排除色谱和亲和层析等。
通过这些技术，可以高效准确地测定蛋白质的含量和纯度。
4.光谱法光谱法是一种快速准确测定蛋白质含量的方法。
在紫外-可见吸收光谱法中，通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度，可以间接测定其含量。
此外，还有荧光光谱法和圆二色光谱法等。
这些光谱法可以快速定量蛋白质的含量，并了解蛋白质的构型和结构。
除了上述方法外，还有一些辅助分析方法，如蛋白质互作法（如蛋白质关联网分析）、功能学法（如蛋白质酶活测定）和结构分析法（如X射线晶体学）等，可以进一步了解蛋白质的功能和结构。
总结起来，蛋白质组学定量研究常见方法包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
这些方法在蛋白质组学研究中发挥重要作用，可以用于研究蛋白质的表达变化、功能与结构。
随着技术的不断发展，蛋白质组学定量研究方法也在不断更新和完善。
定量蛋白组学技术
定量蛋白质组学技术摘要：定量蛋白质组学可以解析蛋白的表达水平，从而寻找差异蛋白，对一些疾病的早期诊断有辅助作用。
定量蛋白质组学技术的发展是此事业的重点，现今主要致力于凝胶电泳和同位素标记质谱的定量技术发展，而新兴的无标记定量技术也占有一定的地位。
基于各种技术的优缺点，人们根据所做的实验特点选择适合自己的定量方法，或者将几种方法结合进行互补，以求可以得到更准确的结果。
关键词：定量蛋白质组学；电泳；同位素标记；互补在阿尔兹海默症研究中，寻找差异表达蛋白可以帮助早期诊断，而寻找差异表达蛋白需要对蛋白进行定性和定量分析，对定性的蛋白进行定量分析可以解析蛋白的表达水平，从而提供了辅助诊断的依据。
随着研究的需求，蛋白定量分析已经发展为一门学科，可以把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。
现今的定量蛋白质组学技术主要有两种，一是基于凝胶，二是基于质谱[1]。
基于凝胶的定量蛋白质技术中，最经典的是双向电泳，第一向按蛋白质的等电点进行分离，第二向则按蛋白质的分子量分离。
双向电泳最早应用于E.coli的蛋白定量，分离出1000个蛋白左右[2]。
双向电泳之所以称之为经典，是因它拥有诸多优势，一是应用的范围广，适合用于各类材料；二是成本较低廉，无论是分析少量的样本，还是分析大量的样本，都比较经济可行；三是出现的早，人们习惯使用且经验足；四是跟上时代的发展，自身在不断的优化，等等。
其中双向电泳的优化是让人们对双向电泳热爱的重点，早期有PH梯度的优化（载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度等）、染色法的优化（考马斯亮蓝、银染、负染和荧光法）；后期预制胶的优化；缓冲液的优化，例如2011年，Domenico等[3]用含有4.5％碘乙酰胺代替缓冲液中的二硫苏糖醇；有结合的优化，特别是与新兴的生物信息学结合，体现出诸多优势，慢慢成为人们的关注重点[4]。
双向电泳中的荧光染色法因其更高的动力学范围和灵敏性，又被另称为双向差异凝胶电泳，最早是由UenlueM等[5]使用的。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。
1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。
化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学定量蛋白质组学hplc2-液色迷人蛋白质组学研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为，即蛋白质的动态表达、动态定位、动态修饰和动态相互作用等，最终的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能，这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定，实现对蛋白质的表达水平及其存在形式变化的检测。
因此，定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。
而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量，而只需对其相对含量进行定量即可。
目前，蛋白质组研究中应用的比较成熟和可信的定量策略和方法主要有两种。
一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量。
1、基于双向凝胶电泳及其染色的蛋白质组学定量技术建立在传统的双向凝胶电泳和染色基础上的定量方法，通过比较不同胶上蛋白质点的染色强度来进行相对定量。
现有的染色方法包括银染、考马斯亮蓝染色，还有最新的荧光燃料。
染色在显示蛋白质的存在的同时，还提供了其表达水平的信息。
传统的双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。
第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing，IEF），使蛋白质根据等电点不同进行分离，第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），即将等电聚焦后的胶条放在SDS-PAGE上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。
由于具有高分辨率的特点，双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。
现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相pH梯度（Immobilized pH Gradient，IPG）等电聚焦技术，具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点，并且可以提供蛋白质的等电点（pI）和分子量（MW）数值信息，有助于蛋白质的鉴定，而且双向凝胶电泳胶上常见的isoform多是蛋白质翻译后修饰的结果，对于这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。
定量蛋白质组学研究技术
定量蛋白质组学研究技术质谱法是一种使用质谱仪来分析蛋白质的方法。
它可以通过测量蛋白质分子的质量和电荷比例，来确定蛋白质的存在和数量。
质谱法有多种不同的变体，包括质谱法，液相色谱质谱法（LC-MS），以及多反应监测质谱法（MRM）。
这些方法结合了高效液相色谱（HPLC）和质谱仪，可以实现高通量的蛋白质分析，同时还可以检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
标记法是一种通过引入标记分子来量化蛋白质的方法。
常用的标记分子包括放射性同位素、生物素、荧光染料和金纳米颗粒等。
这些标记分子可以与蛋白质特定的官能基结合，并通过测量其信号强度来定量蛋白质的存在和数量。
标记法适用于大规模的蛋白质组学研究，可以同时测量大量的样品。
免疫法是一种使用抗体来定量蛋白质的方法。
这种方法通过引入与特定蛋白质结合的抗体，然后使用荧光或酶作为信号分子，来测量蛋白质的数量。
免疫法可以用于分析特定蛋白质或蛋白质家族的表达和定量。
同时，由于抗体具有高度的特异性，免疫法还可以用于检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
除了上述常用的方法，还有一些新兴的定量蛋白质组学研究技术。
例如，双重标记代谢组学（DIA）是一种结合了质谱法和标记法的新方法，可以同时测量整个蛋白质组的表达和修饰。
单细胞蛋白质组学是一种用于分析单个细胞蛋白质组的技术，可以揭示细胞间的异质性和复杂性。
总之，定量蛋白质组学研究技术是一种重要的工具，可以帮助我们更深入地了解生物体内蛋白质的存在和功能。
这种技术可以通过多种方法实现，包括质谱法、标记法和免疫法等。
随着技术的发展，新的定量蛋白质组学研究技术也在不断涌现，将为蛋白质组学研究带来更多的机会和挑战。
定量蛋白质组学研究技术
中 图 分 类 号 ： ５ Ｑｌ 如 果 把 Ｏ’ ａｒｌ在 １ ７ Ｆｒ ｌ ｅ ９ ５年 运 用 二 维 凝 胶 电 泳
一
或 多肽具 有 不 同 的 离子 化 能力 ， 以不 能 够 通 过 质 所
谱 图 对 蛋 白 质 或 多 肽 进 行 定 量 分 析 。 但 是 ， ｄ Ｏａ 等 提 出稳 定 同位 素 代 谢 标 记 的方 法 和 Ｇ ｇ 等 ｙｉ 提 出 的 同 位 素 亲 和 标 签 技 术 （ｓｔｐ ．ｏ ｅ ｆ ｉ ｉ ｏ ｅｃｄ ｄ ａ ｉ ｔ ｏ ｆ ｎｙ ｔｇ ，Ｃ Ｔ） 妙 解 决 了 这 个 问 题 。 此 外 ， 有 蛋 白 ａｓ ＩＡ 巧 还 质 芯 片 技 术 ， 可 用 于 定 量 蛋 白 质 组 学 研 究 。接 下 也 来 将详 细 介绍 这些 技 术 。 １ ．利 用 荧 光 染 料 进 行 定 量 的 蛋 白 质 组 分 析 技 术
片技 术 。
关键 词 ： 量 蛋 白质 组 学； 白质 荧光 染 色技 定 蛋 术 ； 白质 芯 片 技 术 ； 位 素 标 记 技 术 ； 蛋 同
同位 素 亲 和 标 签 技 术
才 能检 测 出 细 胞 中低 拷 贝 蛋 白 ；４ 染 色 不 影 响 后 （）
续 的鉴 定 过程 ， 即它 不 影 响 蛋 白 质 或 多肽 分 子在 质 谱 仪 中 的离子 化 过 程 。但 是 ， 目前 大 多 采 用 的考 马 斯亮 蓝 法或 银 染 法 ， 不 能 完 全 符 合 上 述 的几 点 都
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学对特定已知蛋白质进行质谱检测，而不会像发现蛋白质组那样对所有未知蛋白进行全检测定量蛋白质组是指对特定已知蛋白质进行质谱检测，而不会像发现蛋白质组那样对所有未知蛋白进行全检测。
中文名定量蛋白质组学科技如荧光显微镜，流式细胞仪核心是利用MRM扫描方式实质对特定已知蛋白质进行质谱检测诞生在现代研究技术，如荧光显微镜，流式细胞仪和蛋白质芯片技术中，抗体仍然扮演着非常重要的角色。
但依赖于抗体的蛋白质检测存在一些缺点，其中最大的限制就是，抗体的可用性和质量差别很大。
一些大规模项目，比如人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas），Antibodypedia，以及美国NIH研究院的Health Protein Capture Reagents Program等，都在通过分析人类蛋白靶标有关的抗体的系统生发和特征，来寻找解决这些问题的方法。
不过还有另一条路——质谱，这也许是蛋白组学研究中最熟悉的一种技术了，这种方法能用于特异性分析靶标兴趣蛋白。
在最成熟的定向分析技术，也就是选择反应监控技术（selected reaction monitoring，SRM）中，一种称为三重四极杆质谱仪（triple quadrupole）技术的质谱方法能检测到独一无二的特异性肽段，帮助研究人员高灵敏度，可重复性的定量监测这些蛋白。
同期Nature Methods杂志的另外一篇“Mass spectrometry–based targeted proteomics”文章，简要介绍了这项技术的总体情况，对比介绍了以发现为基础的蛋白质组学分析的定向质谱技术流程，作为一种入门材料，值得一看。
定向蛋白质组的核心是利用串联四级杆质谱特有的MRM扫描方式来定向检测蛋白质，通过软件计算要检测蛋白质的肽对应的母子离子对，用串联四级杆质谱进行MRM扫描，得到MRM色谱峰，一般还会进行MSMS扫描，以对这些肽的MRM进行序列确认，或利用MSMS进行定性和翻译后修饰位点检测等。
蛋白组学定量蛋白质组学
如果能将这些烷基化标记的肽段给分离出来鉴定和定量，既
能检测到足够多的蛋白质，又大大减少了工作量，更适宜大 规模操作。
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d0/d8法（ICAT方法）
同位素标记的亲和标签方法(Isotope – Code Affinity Tag)
ICAT试剂是一种人工合成的有机分子，包括三个部分：
反应基团，可特异的与蛋白质侧链上的Cys残基的巯基(-SH)进行 反应，使试剂共价结合在蛋白质侧链上。
但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功 能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞 体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定 量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被 提出来。
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常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
收获不同同位素标记的不同生长状态下的细胞，混合裂解，再 做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。
这种蛋白质定量策略称为SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，细胞培养物中含有稳定同位素 的氨基酸标记)
磷酸化修饰定量： X：未被磷酸化的肽段 Xp：被磷酸化的肽段 X 被 磷 酸 化 成 Xp 后 分
子量会增大，在MS图 谱上峰会迁移
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特点
代谢标记方法比较准确和稳定,可以检测 蛋白质在pmol浓度内的20％的量的变化。