猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

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猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书[兽用名称]猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗商品名：无英文名：Swine Transmissble Gastroenteritis,Porcine Epidemic Diarrhea and Porcine Rotavirus Vaccine，live汉语拼音：Zhu Chuanranxing Weichangyan、Zhu Liuxingxing Fuxie yu Zhu Lunzhuangbingdu Sanlian Huoyimiao【主要成分与含量】疫苗含猪传染性胃肠炎病毒弱毒化毒株和猪流行性腹泻病毒弱毒CV777株病毒和猪轮状病毒NX株，每头份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。

【性状】为黄白色或微粉色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，无异物。

【作用与用途】用于预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒感染。

主动免疫接种后7日产生免疫力，免疫期为6个月。

仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7日。

【用法与用量】每瓶疫苗稀释至5ml或10ml（根据头份数），妊娠母猪与产仔前40日后海穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）接种，20日后二免，每次1头份（1ml）；其所生仔猪与断奶后7-10日内接种疫苗1头份。

未免疫母猪所产3日龄以内仔猪接种1头份；进针深度：3日龄仔猪为1.5cm，随猪龄增大而加深，成猪为4cm。

【不良反应】无。

【注意事项】1. 产品仅用于控制这三种病毒引起的腹泻，对于细菌、寄生虫和其他因素引起的腹泻无效。

2. 疫苗运输过程中应防止高温和阳光照射。

3. 妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，以免引起机械性流产。

4. 疫苗稀释后，限1小时内用完。

5. 进行抗体检测，在抗体水平较低（TGE、PED中和抗体效价≤1:8，PRV中和抗体效价≤1:16）的情况下使用。

6. 后海穴位接种时，针头保持与脊柱平行或者稍偏上，以免将疫苗注入直肠内。

四重荧光qRT-PCR检测猪腹泻相关病毒方法的建立

四重荧光qRT-PCR检测猪腹泻相关病毒方法的建立包雯骏;张强;李树清;林颖峥;李健;严亚贤【摘要】为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的四重荧光qRT-PCR检测方法,本研究以PEDV的N基因、TGEV的S基因、PDCoV的M基因和PTV基因组5'非编码基因为检测对象,建立同时检测4种病毒的荧光RT-P C R方法.结果显示,该方法可以特异扩增4种病毒的基因,不能扩增猪呼吸道冠状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的基因;PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的最低核酸检出量分别为141、68、8和11拷贝数;对100份送检样品进行检测,其中PEDV、TGEV、PDCoV和PTV感染检出率分别为10％、6％、2％和55％.结果表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性,而且操作快速简便,可用于猪腹泻疫病的临床诊断和流行病学调查.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)006【总页数】6页(P42-47)【关键词】猪流行性腹泻病毒;猪传染性胃肠炎病毒;猪delta冠状病毒;猪捷申病毒;四重荧光RT-PCR;检测【作者】包雯骏;张强;李树清;林颖峥;李健;严亚贤【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6近年来，规模化猪场猪腹泻类疫病复杂程度日益增加，给养猪业造成了严重的经济损失，在世界范围内受到越来越多关注。

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用王　劭1,2　陈少莺1,23　林锋强1,2　程晓霞1,2　江　斌1　陈仕龙1,2　林　琳1　朱小丽1(1　福建省农业科学院畜牧兽医研究所　福州　350013;2　福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心　福州　350013)摘　要　根据G en Bank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TG E V)基因序列,针对T GE V N基因全序列设计合成了一对引物,以TG E V疫苗株为模板,建立了检测TG E V的RT-PCR方法。

应用该方法对TG E V疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGE V不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TG E V-N-cDN A;对猪传染性胃肠炎(TG E)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TG E V N基因片段。

结果表明建立的RT-PCR方法对TGE V的检测敏感性高、特异性强,可用于TGE V感染的诊断和流行病学调查。

关键词　猪传染性胃肠炎病毒　RT-PCR　检测　应用中图分类号:S852165+916 文献标识码:A 文章编号:1003-4331(2007)07-0043-04Development and a pplication o f RT-PC R method for detecti ng sw ine transmissible g a stroenter itis vir usW ang Shao1,2　Chen Shaoying1,23　Lin Fengq iang1,2　Cheng X iaox ia1,2　Jiang Bin1　Cheng Shilong1,2　Lin Lin1　Z hu X iaoli1 (1Ins titute o f Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fu Jian Academy of A griculture Sciences,Fu zh ou　350013;2Fujian Animal Diseases C ontrol T echn ol og y Dev elo pment Center,Fuzhou　350013,China)Abstract　A pair of primers were designed and synthesized based on the sequences of the TG E V gen omes,and the RT-PCR meth od to d etect the transmissible gastroenteritis virus(TGE V)w ere developed.The1168b p s pecifical fragment w ere obtain ed f rom the TGE V vaccine s train RNA by this RT-PCR.T he nucleotide h omogeneity o f the g ene sequence of RT-PCR product achieved to95%～97%w ith that of other TG E V strains.T he sensitiv ity of RT-PCR reached to18pg TG EV-N-cDN A.Thes e resu lts sho wed that the RT-PCR meth od t o detect TG E V were o f better s pecificity and higher sensibility.T he sample o f TG E was detected th e s pecial N g ene o f TG E V.T he resu lts sh owed that th is PCR technique was s pecific and applied to TG EV d iag noses and epidemiology inves tigati on.K ey w or ds　transmiss ib le gas troenteritis v irus　RT-PCR　detection　application 猪传染性胃肠炎(Transm i ssible gastr oenteritis, TG E)是由冠状病毒科的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteriti s virus,TG EV)引起的猪的一种高度接触性传染病。

检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建

收稿日期：2015-04-27
基金项目：公益性行业（农业）科研专项项目（201203056）
作者简介：滑翔男（1993-），，新疆哈密人，硕士生，主要从事动物疫病分子生物学研究，E-mail：huaxiang722@。胡中凯，男，硕士生，
从事动物传染病工作，在本研究设计和实施中做了重要贡献，为本文共同第一作者，E-mail：huzk1986@
曹三杰男山西乡宁人教授博士生导师通信作者 *
：
（1971-），，
，，
，E-mail：csanjie@
2236
畜牧兽医学报
卷 46
bedetectedbysixprobesandasfewas20pg·μL-1oftargetplasmindsweredetectedsuccessfully.Onemicroarraycouldbetestedatleast7times.Thisassayprovidedanovelandhighthroughputdetectingtechnologytoidentificationanddetectionofthreediarrhealviruses. KeyWords：porcineepidemicdiarrheavirus；transmissiblegastroenteritisvirusofswine；porcine rotavirus；cDNAchip；establish
中图分类号：S858.285.3；S6-6964（2015）12-2235-08
ConstructionofcDNA MicroarrayforDetectingPorcineEpidemicDiarrheaVirus， PorcineTransmissibleGastroenteritisVirusandPorcineRotavirus

猪腹泻相关的冠状病毒检测方法研究进展

2021第1期 109猪腹泻相关的冠状病毒检测方法研究进展向萌1，陈弟诗2，任玉鹏1，王一丹1（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041）中图分类号：S858.285.3 文献标志码：Ａ文章编号：1002-1957(2021)01-0109-04摘要猪冠状病毒是猪病毒性腹泻的一类重要病原，感染仔猪死亡率可达100%，给养猪业带来了巨大的经济损失。

文章将对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒以及猪急性腹泻综合征冠状病毒等4种猪冠状病毒检测方法研究现状进行总结，对各种方法的优缺点和应用前景进行系统的讨论和展望，以期为临床上猪冠状病毒的高效检测、精准防控，以及未来猪冠状病毒新型检测方法的研究提供新思路。

关键词猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪德尔塔冠状病毒；猪急性腹泻综合征冠状病毒；检测方法收稿日期：2020-12-10基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目（CX2020SZ68）作者简介：向萌（1995-），女，土家族，湖北恩施人，在读硕士研究生，研究方向为动物传染病病原学.E-mail:****************通讯作者：任玉鹏（1986-），男，讲师，博士，研究方向为动物病原分子生物学研究.E-mail: *********************猪腹泻病是危害养猪业主要的传染病之一，其中以病毒性腹泻的发生率最高、危害最严重[1]。

冠状病毒是引起仔猪腹泻的重要病原，主要包括猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine delta corona virus, PDCoV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）[2]。

猪传染性胃肠炎病毒_猪流行性腹泻_省略_轮状病毒多重PCR检测方法的建立_路超

株的N 蛋白是很难实现的。

本试验将OＲF7基因片段与pET －28a （+）载体连接，构建克隆质粒PＲＲSV OＲF7－pET －28a ，再将其导入大肠杆菌表达系统中表达。

由于pET －28a （+）载体的N 端和C 端都携带编码6个组氨酸的基因序列，因此通过限制性内切酶Bamh Ⅰ和Xho Ⅰ对pET －28a （+）载体上的特定酶切位点酶切，以及T4连接酶对OＲF7基因片段和酶切后的pET －28a （+）载体的连接，使OＲF7基因序列与编码6个组氨酸的基因序列连接，表达出来的疫苗株N 蛋白携带6个组氨酸，这样疫苗株的N 蛋白与野毒株的N 蛋白形成了差异化，这为区分疫苗株N 蛋白和野毒株N 蛋白奠定了基础。

参考文献：［1］HAN K ，SEO H W ，PAＲK C ，et al．Vaccination of sows against type2Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （Prrsv ）be-fore artificial insemin －ation protects against type 2Prrsv challenge but does not protect against type －1Prrsv challenge in late gestation ［J ］．Vet Ｒes ，2014，45（12）：2－11．［2］金光明，王珏，宁康建，等．PＲＲSV 弱毒细胞疫苗与灭活疫苗生殖道黏膜免疫效果观察［J ］．中国农学通报，2005，21（3）：34－36，44．［3］赖志，黄锡琴，龚建培，等．猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH －1Ｒ株）工厂化生产培养条件的研究［J ］．中国预防兽医学报，2010，32（8）：615－618．［4］李婷婷．与PＲＲSV 核衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与验证［D ］．武汉：华中农业大学，2010．［5］陈玲．猪繁殖与呼吸综合征病毒N 蛋白原核表达及单克隆抗体的研制［D ］．南京：南京农业大学，2009．［6］李淑娟．六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究［D ］．西安：西北大学，2007．［7］阮建兵，梅艳珍．多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用［J ］．生物技术通报，2012（6）：49－53．［8］姜丽英．猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制［D ］．扬州：扬州大学，2008．［9］李素平．PＲＲSV 重组N 蛋白ELISA 检测方法的建立及单克隆抗体的制备［D ］．郑州：河南农业大学，2009．［10］石文达，刘永刚，王洪峰，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒CH －1Ｒ株全基因组序列测定及遗传变异分析［J ］．中国预防兽医学报，2010，32（7）：512－516．（011）收稿日期：2015－05－14；修回日期：2016－02－13基金项目：天津市农业科学院院长基金项目（12005）作者简介：路超（1978－），女，助理研究员，本科，研究方向为病原分子生物学，檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼殥殥殥殥shuaimao2006@163．com．猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪A 群轮状病毒多重PCＲ检测方法的建立路超1，张莉1，韩伟1，2，王利丽1，杨春蕾1（1．天津市畜牧兽医研究所，天津300384；2．天津市伍峰农生物技术有限公司，天津300384）中图分类号：S852．65+9．4；S855文献标识码：B文章编号：1004－7034（2016）05－0180－04关键词：猪流行性腹泻病毒（PEDV ）；猪传染性胃肠炎病毒（TGEV ）；猪A 群轮状病毒（ＲV ）；多重PCＲ；引物设计；条件优化摘要：为了能够同时快速准确检测出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV ）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcinetransmissible gastroenteritis virus ，TGEV ）及猪A 群轮状病毒（Porcine rota-virus ，ＲV ），试验通过设计引物、优化PCＲ条件构建了一个能同时检测出TGEV 、PEDV 及ＲV 的多重PCＲ方法。

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用于长青;林树伯;刘乐荣;王庆博;李继良【摘要】用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒.以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR Green Ⅰ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增.结果显示,扩增效率为100.4％,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3％.用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P＜0.05)高于常规PCR方法.研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2015(030)003【总页数】4页(P44-47)【关键词】猪流行性腹泻病毒;SYBR Green Ⅰ;荧光定量PCR;早期快速诊断【作者】于长青;林树伯;刘乐荣;王庆博;李继良【作者单位】天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是猪流行性腹泻（PED）的病原，PED是一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水消瘦为临床特征，不同年龄大小的猪都容易感染和发病，尤以哺乳仔猪（1周龄内）受害最为严重［1］。

2010年以来，PED在中国多个省份局部暴发，造成新生仔猪大量死亡，给养猪业造成了惨重损失［2－3］。

猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法与设计方案

本技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ PCR检测方法。

本技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的特异性引物和探针，并建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ PCR检测方法。

本技术的特异性引物、探针和检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

技术要求1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示。

2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种；优选地，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。

4.权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

5.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2；优选地，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ IDNO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。

PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法的建立

PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法的建立猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PRoV）是导致猪腹泻的三种主要病毒性病原,对各年龄段的猪都易感,尤其会造成幼龄仔猪极高的病死率,给我国以及世界上其他的养猪国家造成了巨大的经济损失。

临床常发生这三种病毒的混合感染,相对于单一感染,对肠道的损伤更为严重。

三种病毒感染后的临床症状和病理变化十分相似,给疾病的准确诊断和防控带来诸多困难。

高效、快捷的病毒病原鉴定方法可以快速诊断疾病的病因,以便及时处置,减少疾病带来的损失。

目前检测这三种病毒的方法主要有RT-PCR法、ELISA法和胶体金试纸条法,胶体金试纸条法快捷,但灵敏度低;ELISA法特异性好、灵敏度高、操作简单,但一次仅能检测一种病原;RT-PCR法虽然可实现3种病原的联检,但操作繁琐、耗时耗力、专业性强,易污染。

因此,建立能同时检测并区分这三种病原的特异、敏感、快速、高效的检测方法对临床诊断具有重要意义。

本研究拟应用蛋白质芯片技术,基于双抗体夹心检测抗原的原理,利用PEDV、TGEV、PRoV单克隆抗体作为捕获抗体和标记抗体,建立一种具有高度特异性、敏感性的高通量检测方法,为临床上PEDV、TGEV、PRoV所引起的猪病毒性腹泻疾病的鉴别诊断提供一种新的技术手段。

首先复苏实验室前期制备的PEDV、TGEV、PRoV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化,对纯度和浓度进行鉴定,同时对单克隆抗体进行HRP标记。

基于单抗-抗原-酶标单抗的双抗体夹心原理,以变性硅胶膜为载体,利用制备的单克隆抗体构建PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片,并对三种病毒单克隆抗体的配对模式、芯片反应模式、捕获抗体最佳使用浓度、酶标抗体最佳稀释倍数、反应时间及显色时间等进行筛选,优化和确定蛋白质芯片的检测条件,并对蛋白质芯片的特异性、敏感性、重复性及方法学对照进行研究和评价。

猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立

中P兽医科学 2020,50(12): 1500-1508Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-L0-15 DOI：l0.16656/iissal673-46962020.0206 中图分类号:S852.659.6:S852£59.4 文献标志码:A文章编号：1673-4696(2020)12_ 1500-09猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立许梦怡U，王彦红i，2*，薛峰〇(1•扬州大学兽医学院，江苏扬州225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009;3•江苏省淮安生物T.程高等职业学校，江苏淮安223200;4.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095)摘要：根据T G E V的M基因、P E D V的M基因和P o R V的V P2基因序列，通过优化引物、探针浓度和退火温度，确定了最佳的反应体系和扩增程序，成功建立了这3种病毒的T a q M a n探针单重荧光定量P C R 方法。

在此基础上，经过进一步的条件优化，建立了检测T G E V、P E D V、P o R V的三重实时荧光定量P C R方法，该方法对 T G E V、P E D V、P o R V 的检测灵敏度分别为 2.49copies/M L、4.36copies/fiL、4.96copies/n L, T G E V、P E D V、P o R V的组内重复试验的C V最大值分别为2.5%、3.8%、4.3%，组间重复性试验的C V最大值分别为3.7%、3.4%、3.2%,均不超过5%，表明建立的方法重复性好；用此方法对？!^\?(：¥1、？1^^乂病毒样本进行检测，均没有交叉反应，表明该方法特异性好；用建立的方法对临床4 0份病料样品进行了检测，结果显示，T G E V、P E D V、P o R V的阳性检出率分别为5%、30%、12.5%;其中T G E V与P E D V混合感染率为2.5%;P E D V与P o R V混合感染率为5%;多重荧光定量P C R方法与单一荧光R T-P C R方法的检测结果均一致，表明建立的方法具有很好的临床应用价值：关键词：猪传染性胃肠炎病毒；猪流行性腹泻病毒；猪轮状病毒；T a q M a n荧光定量P C REstablishment and application of multiplex RT-PCR procedure fordetection of three virus from swineXU Meng-yil 3,WANG Yan-hong1'2* ,XUE Feng4*(1. College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009, China；2.Jia/igsu Co-lnnovaiion Center f or Important Animal Infectious Diseases (uid Zoonoses,Yangzlwu 225009, China；3.Huaian Higher Vocational School of B iological Engineering, Jiangsu Province Munian 223200, China ；4.College of Veterinary Medicine ,Nanjing A griculturaJ University ,l\anjing 2\0095 ,China)Abstract：Based on the M gene sequence of TGEV and PEDV and VP2 gene sequence of PoRV,the optimal reaction system and amplification procedure were established by optimizing primer,probe concentration and annealing temperature,and the Quantitative PCR method of TaqMan probes for three viruses is successfully established.On this basis,after further optimization of conditions,a triple real-time fluorescent quantitative PCR method for detecting TGEV,PEDV,and PoRV was established.The detection sensitivity of this method for TGEV,PEDV,and PoRV were 2.49 copies/ fiL,4. 36 copies/M L,and 4.96收稿日期：2020-08-05;修回日期：2020-10-09基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD);江苏高校品牌々•业建设工程资助项目（PPZY2015B158);国家重点研发计划项目（2017YFF0208600)作者简介：许梦怡（1990-)，女，江苏淮安人，硕士生，研究方向为兽眹学，E-mail :*****************通讯作者：王彦红(1974-)，女，讲师，博士，研究方向为临床兽医学，E-mail :wyh7405@163. com;薛峰，教授，博士，研究方向为人兽共患病病原学、致病机制、检测诊断新技术，E-mai 1:xuefeng @njau. edu. cn :第12期许梦怡等：猪传染性胃肠炎病毒玷流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建£1501copies/respectively.The maximum value of CV in repeated trials detected by TGEV, PEDV and PoRV were 2.5%,3.8%,4. 3%,and the maximum value of CV in repeated trials between groups were 3.7%,3.4%,3.2% , which are no more than 5%. indicating that the established method has good ing this method to detect P R V,PCVl,and PRRSV virus samples,there is no cross-reaction,indicating that the me thod is specific. Using the established method to detect 40 clinical diseases,the samples were tested,and the positive rates of TGEV,PEDV,and PoRV were 5%, 30%,and 12. 5% respectively.The mixed infection rate of TGEV and PEDV was 2.5% ,the mixed infection rate of PEDV and PoRV was 5%.The results of the multiple fluorescence quantitative PCR method are consistent with those of the detection of a single fluorescent RT-PCR method,indicating that the established method has good clinical application value.Key words：T G E V；PE D V；PoRV；TaqMan quantitative RT-PCR* C orresponding authors：W A N G Y a n-hon g,E-mail：w y h**********o m；X U E F e n g,E-mail ：xuefeng@ 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)、猪流性腹泻病毒（PEDV)以及猪轮状病毒（PoRV)是3种主要引起猪腹泻病的病毒病原13:，这3种病毒性腹泻造成猪场仔猪死亡、成年猪吃而不长，最终导致畜主财产损失，其不仅在我国广泛流行，在欧洲、美洲等地也广泛存在，是一种世界性的疾病。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【摘要】通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及猪轮状病毒（RV）的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。

该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明：建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。

%Three pairs of primers amplified genes of transmissible gastroenteritis virus（TGEV）,porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and porcine rotavirus（RV） respectively were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV,PEDV and RV.The established PCR can detect M gene with the length of 252bp of TGEV,N gene with the length of 540 bp of PEDV and VP7 gene with the length of 412 bp of RV.Negative results when using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 100-pg nucleotide per PCR reaction.Twenty six diarrheal fecal samples collected from viral diarrheal piglet were submitted to detect TGEV,PEDV and RV,and the result showed that this multiplex RT-PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity can be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.【期刊名称】《龙岩学院学报》【年(卷),期】2011(029)005【总页数】4页(P55-58)【关键词】猪传染性胃肠炎;猪流行性腹泻;猪轮状病毒;多重PCR;诊断【作者】郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【作者单位】龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心,福建龙岩364012【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE），猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）及猪轮状病毒（Porcine rotavirus，RV）感染，是猪场常见的病毒性腹泻，此三种病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损失，是危害猪场最严重的疾病之一[1-2]。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

泻疫情相关，为了评估ＰＢｏＶ与ＴＧＥＶ以及ＰＥＤＶ的流行是否有混合感染的现象，对这３种病毒进行
了检测。由于临床诊断非常困难，因此必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。以往的血清学诊断准
异、易于操作的优点，可用一个样品同时检测多种病
原体，达到对多种疾病的同步诊断，缩短检测时间，减少试剂消耗。因此，本文开展了多重ＰＣＲ检测
泻。２０１０年，ＳｈａｎＴ Leabharlann 等。在无临床症状的猪
猪传染性胃肠炎病毒（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎ —
ｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＴＧＥＶ）、猪流行性腹泻病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ
相似的症状，经常会发生混合感染，而ＰＢｏＶ又与腹
ｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ，ＰＥＤＶ）和猪博卡病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｂｏｃａｖｉｒｕｓ，ＰＢ０Ｖ）都是与猪腹泻相关的肠道病毒。
其中由ＰＥＤＶ和ＴＧＥＶ引起的高度接触性腹泻性
法可以应用于临床检测。
关键词：猪传染性胃肠炎病毒；猪流行性腹泻病毒；猪博卡病毒；多重ＰＣＲ；检测
中图分类号：￥８５８．２８；Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１３）０８ — ００７１ — ０５

哈兽研首创“一针防三病”三联活疫苗获国家技术发明二等奖

近日，“互联网+”助力毛皮动物产业———“狐联网”战略发展研讨会在中国农业科学院特产研究所召开。

会议以融合、创新、发展为主题，围绕国家特种经济动物科技创新联盟2018年重点工作计划，探讨产业互联网助力毛皮动物产业发展的模式。

中国农业科学院特产所所长、国家特种经济动物科技创新联盟理事长李光玉在致辞中指出，特产所在毛皮动物的资源收集整理和遗传育种、繁殖技术、疾病防控、设备设施、产品加工等全产业链条研究领域都有深厚的研发基础，并于2018年4月份牵头成立国家特种经济动物科技创新联盟，旨在解决特种经济动物行业发展重大战略与共性技术难题和制约产业发展重大关键性技术问题。

他强调，充分发挥互联网在生产要素配置中的优化和集成作用，将互联网的创新成果深度融合在特种经济动物这样的传统行业，是新时代的需求，也是未来产业发展的方向。

特产所将联合相关单位发挥科技创新联盟的作用，通过互联网的优势整合毛皮动物产业各个环节的资源，进一步推动毛皮动物产业的健康快速发展。

会上，电商企业平台相关人员详细介绍了“狐联网”平台开发设计的理念以及未来运营发展规划，并现场演示了相关操作与使用流程。

与会人员就“狐联网”模块设计与科技专家支撑服务于“狐联网”平台的方式等进行了交流和探讨。

打破我国种猪长期依赖进口困境华农教授吴珍芳牵头破解种猪育种关键技术17讯资责任编辑：赵昆昆电话：0311-********E-mail:1398659867@2018年全国执业兽医资格考试合格分数线为234分1月9日农业农村部网站发布《全国执业兽医资格考试委员会公告第21号（以下简称公告）》，2018年全国执业兽医资格考试成绩于2019年1月10日公布，考生自2019年1月10日零时起可登录中国兽医网（）全国执业兽医资格考试网上信息平台查询本人成绩。

《公告》提出，全国执业兽医资格考试委员会决定：2018年全国兽医全科类执业兽医师和执业助理兽医师合格分数线分别为234分和208分。

猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立郑世民;周首龙;赵良友;刘超男;高雪丽;吕晓萍【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】为建立猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的快速检测方法，参照GenBank已发表序列，根据TGEV和PEDV的S蛋白基因结构各设计1套特异性通用引物，扩增目的带分别为426和583 bp。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外光下于500 bp上、下各有一条电泳带，达到区分和鉴别目的。

经优化确立最佳反应体系：引物、MgCl2和dNTP浓度分别为8、9和14μmol·L-1，退火温度54℃。

该方法在捕获信息和复杂基因分析方面具有快速、敏感、特异、低成本等优点，可为TGEV和PEDV检测及TGE和PED流行病学调查等提供技术支持。

【总页数】5页(P57-60,90)【作者】郑世民;周首龙;赵良友;刘超男;高雪丽;吕晓萍【作者单位】东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030;东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030;黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，哈尔滨 150040;东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030;东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030;东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1【相关文献】1.猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立 [J], 杜鹃;韦海涛;宋彦军;郑瑞峰;付彩霞;何伟勇;郭峰;李佳;吴惠明2.猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR 检测方法的建立与应用 [J], 胡鸿惠;南文金;黄健强;吴静波;彭国良3.猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 [J], 李军;卢体康;陈金顶;秦智锋;蔡良语;陈兵;刘建利;孙洁;陈书琨;林庆燕;陶虹;吴绍强4.猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立 [J], 李敬双;于洋5.猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立 [J], 赵雯雯;李敬双;赵晓岚;靖杰;赵禹冬;智诗文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用张坤;何启盖【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2010(41)8【摘要】本试验旨在建立能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR检测方法.根据GenBank收录的PEDV M基因、TGEV N基因、GAR VP7基因,利用软件Primer 5.0设计合成能分别特异性扩增PEDV、TGEV、GAR相应基因的引物.利用这3对引物,作者建立了一种新的能够同时检测PEDV、TGEV和GAR的多重RT-PCR方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较.实验室检测中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-GAR三联苗的混合RNA.应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析,结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR的敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%.该方法敏感性高、特异性强,是一种新的检测PEDV、TGEV和GAR的方法.【总页数】5页(P1001-1005)【作者】张坤;何启盖【作者单位】华中农业大学动物医学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉430070;华中农业大学动物医学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S858.285.3;S852.659.6【相关文献】1.猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立 [J], 焦洋;姜焱;王凯民;张常印;雷治海;唐泰山2.一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用 [J], 于新友;李天芝;沈志强3.猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR 检测方法的建立与应用 [J], 胡鸿惠;南文金;黄健强;吴静波;彭国良4.猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 [J], 李军;卢体康;陈金顶;秦智锋;蔡良语;陈兵;刘建利;孙洁;陈书琨;林庆燕;陶虹;吴绍强5.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用 [J], 丁庆文;闫晓光;张红垒;李倩倩;张云飞;舒祥力;单法;李林姣;胡慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗外源病毒检验方法

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联
活疫苗外源病毒检验方法
佚名
【期刊名称】《中国动物保健》
【年(卷),期】2016(18)3
【摘要】根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，我部组织修订了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗（弱毒华毒株＋弱毒CV777株＋NX株）外源病毒检验方法，现予发布，自发布之日起执行。

原我部发布的该产品外源病毒检验方法同时废止。

【总页数】1页(P76-76)
【关键词】猪传染性胃肠炎;猪流行性腹泻;三联活疫苗;猪轮状病毒;检验方法;外源病毒;《兽药注册办法》;《兽药管理条例》
【正文语种】中文
【中图分类】S858.286.4
【相关文献】
1.猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗创制与应用 [J],
2.2018年度国家技术发明奖二等奖猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗创制与应用 [J], ;
3.十载铸防控之盾一朝驱腹泻狂魔——记2018年度国家技术发明奖二等奖项目“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗创制与应用” [J], 蔡萌
4.猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗创制与应用 [J],
5.10年磨一剑哈兽研维科生物首创的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗隆重上市 [J], 张晓鹏;秦红丽
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郑新添，杨小燕，戴爱玲，李晓华，陈星星
（１．龙岩学院生命科学学院；
２．福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究ｑ－心福建龙岩
３６４０１２）
摘要：通过设计三对引物分男，ｌ扩增猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）、猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）￣猪轮状病毒（ＲＶ）的特异性基因。建立了一个能对ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ及ＲＶ感染鉴别诊断的三重ＰＣＲ方
毒（ＰＲＶ）阳性病料由本实验室保存；２６份疑似病毒性腹泻粪样采自龙岩学院动物医学研究所接诊病例。猪肾细胞ＰＫ一１５由本实验室保存。
１．２主要试剂Ｍ— ＭｕＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、
过设计三对引物，分别扩增ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ及ＲＶ的
ＲＶ序列，设计３对特异性扩增引物（表１），其中引物对ｔ（ＴＧＥＶ — ＭＰ — ＵＰ／ＤＮ）扩增ＴＧＥＶＭＰ基因．引
物对ｐ（ＰＥＤＶ — ＮＰ１／２）扩增ＰＥＤＶＮＰ基因，引物对ｒ
法该方法能同时检测ＴＧＥＶ的Ｍ基因２５２ｂｐ片段、ＰＥＤＶ的Ｎ基因５４０ｂｐ片段及ＲＶ的ＶＰ７基因
４１２ｂｐ片段。而对ＣＳＦｖ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ等无扩增，其检测ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ及ＲＶ的极限为１０Ｏｏｇ
４ ℃保存ＰＣＲ产物。同时，对多重ＰＣＲ反应体系的
引物浓度。退火温度等进行优化。
２．５特异性试验
倒混匀。４ ℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，ｌｍＬ
７５％乙醇洗涤。４￣Ｃ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，自然干
由于ＴＧＥ、ＰＥＤ及ＲＶ有相似的临床表现及传染途
径，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术【１，如病毒分离、免疫荧光试验、ＰＣＲ技术等；传统的诊断技
术如病毒分离、免疫荧光试验等费时费力，不适于
ｐＭＤ一１８ＴＶｅｃｔｏｒ、ＤＮＡ分子质量标准ＤＬ２０００、Ｔａｑ酶等购自大连Ｔａｋａｒａ宝生物工程有限公司。Ｔｒｉｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ购白天根生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
猪传染性胃肠炎（ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，
ＴＧＥ）．猪流行性腹泻（ＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａ，
泻及猪轮状病毒感染鉴别诊断的三重ＰＣＲ体系，
１．１病毒、病料及粪样：ＴＧＥＶ — ＰＥＤＶ — ＲＶ三联灭
活疫苗（批号０９０５００１，山东农科院畜牧兽医研究
所）；猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）、猪呼吸与繁殖综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）、猪圆环病毒２型（ＰＣＶ一２）和猪伪狂犬病
失．是危害猪场最严重的疾病之一【。三者均为高度接触性肠道疾病，分别由猪传染性胃肠炎病毒（ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＴＧＥＶ）、猪流行性腹泻病毒（ＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）及猪轮状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＶ）引起。
２．４多重ＰＣＲ的建立
在单对引物扩增成功的基础上，将表１中３对引物同时加入扩增体系，建立三重ＰＣＲ扩增反应体系。ＰＣＲ反应体系如下：１０ｘＰＣＲｂｆｅｕｒ５１ｘＬ，
本试验所用ＲＮＡ均用Ｔｒｉｚｏｌ法提取，方法参照试剂盒说明书。称取样品（阳性对照：ＴＧＥＶ — ＰＥＤＶ — ＲＶ三联灭活疫苗冻干粉０．１ｇ；阴性对照：ＰＫ１５细胞１０６ｃｅｌｌｓ，ＣＳＦＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ等病料各０．１ｇ；临床检测样品：新鲜粪便样品０．２ｇ），分别加入ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ８００￣Ｌ，室温作用５ｍｉｎ后加入２００氯仿，颠倒混匀。４￣Ｃ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清至新的１．５ｍＬ离心管中，加等体积异丙醇，颠
核酸ｌｌｚＬ；用该方法对临床收集的２６份粪便样品进行检测，结果表明：建立的多重ＰＣＲ方法具有特异性强，强灵敏度高等特点，能用于临床诊断及流行病学调查。
关键词：猪传染性胃肠炎；猪流行性腹泻；猪轮状病毒；多重ＰＣＲ；诊断中图分类号：￥８５８．２８文献标识码：Ａ文章编号：１６７３ — ４６２９（２０１１）ｏ５ — ００５５ — ０４
将疫苗株阳性对照ｃＤＮＡ用ｄｄＨ２０稀释，用紫
外分光光度计测量核酸浓度，按ｌ０倍浓度梯度稀释，将核酸浓度调整至１￣ｇ／ｌｘＬ－１ｐｇ／ｉｘＬ，分别以它们为模板，按优化的多重ＰＣＲ反应体系进行ＰＣＲ扩增。反应结束后，取５ｔｚＬ反应液在１．５％琼脂糖凝
作者简介：郑新添，男，福建上杭人，讲师，主要从事动物疫病诊断、动物传染病区域科技重大项目（２００９Ｎ３０１３）。
万方数据
５５
表１多重ＰＣＲ扩增引物
２方法２．１ＲＮＡ提取
２．３单一病原体基因ＰＣＲ扩增及测序以阳性对照疫苗株ＲＮＡ转录获得的ｃＤＮＡ为模板，分别以表１中的３对引物，作单对引物扩增。扩增体系为１０ｘＰＣＲｂｆｅｕｒ２．５￣Ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
并将其应用于临床检测。
１材料与试剂
ＰＥＤ）及猪轮状病毒（Ｐｏｒｅｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＶ）感染，是
猪场常见的病毒性腹泻，此三种病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损
２．６敏感性试验
在１．５ｍＬ离心管中加入：Ｍ— ＭｕＬＶｂｕｆｅｒ４１ｘＬ，
ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｌｚＬ）０．５Ｌ，Ｍ— ＭｕＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ（５Ｕ／ｔｘＬ）ｌｌｘＬ，ｒａｎｄｏｍｐｉｒｍｅｒ１Ｌ，
燥，加２０ＬＤＥＰＣ水溶解。
２．２ｃＤＮＡ合成
以ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ２、ＣＳＦＶ、ＰＲＶ等病原体的核酸为模板，同时以ＴＧＥＶ — ＰＥＤＶ — ＲＶ疫苗毒株核酸为
阳性对照，进行同等条件下ＰＣＲ扩增，反应结束后．取５１ｘＬ反应液在１．５％琼脂糖凝胶上电泳分析。
第２９卷第５期
２０１１年１０月
龙
岩
学
院
学
报
Ｖｏ１．２９Ｎｏ．５
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＯＮＧＹＡＮＵＮＩＶＥＲＳｎＹ
Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１１
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重ＰＣＲ检测方法的建立
１．３引物根据Ｇｅｎｂａｎｋ登录的ｒＧＥＶ、ＰＥＤＶ及
临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查；
而ＰＣＲ技术具有特异性强，敏感度高，可进行活体
诊断等特点，在实验室诊断中具有较突出的优势［４１。与传统ＰＣＲ逐一扩增单一病原体不同，本研究通