胰蛋白酶最适PH及其稳定性
胰蛋白酶
工业应用
工业上用于皮革制造 生丝处理 食品加工
因为可将多肽链水解成寡肽和氨基酸，因此作 为食品加工助剂切割大分子蛋白。
谢谢大家！
使用条件 底物浓度10~25%，温度50~60℃，PH值 6.0~8.5，反应时间3~6小时（根据要求可长可 短）添加酶0.03~0.06%（以水解溶液重量计 ）保存：5℃保藏，保质期一年；25℃储存， 酶活保存期至少3个月以上
医学上应用
能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀， 易于引流排除，加速创面净化，促进肉 芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
基本作用
在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏 是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为 胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的 限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶， 它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基 侧切断。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜 蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前 体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在 决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少 的工具。
识别序列
胰蛋白酶水解精氨酸或赖氨酸的羧基和 别的氨基酸形成的肽键
蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中 由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链， 能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白 质无作用
酶活力
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底 物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径 1厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253 增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE 单位。
适应条件
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞 离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样 。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有 关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用 能力最强。
酶
【摘要】：本文研究了酶和水解条件对乳清蛋白水解度和水解物DPPH自由基清除率的影响。采用胰蛋白酶,复合蛋白酶,风味蛋白酶,中性蛋白酶以及商业粗酶,碱性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS 1398,在它们的最适水解pH和温度下水解乳清蛋白4h。所有酶水解得到的乳清蛋白水解物都具有抗氧化活性。风味蛋白酶和AS 1398中性酶得到的水解物的DPPH自由基清除率最高,2709碱性蛋白酶具有最高的水解度。和其他酶乳清蛋白水解物相比,胰蛋白酶水解物具有稳定的溶解性,所以被用于研究其他的水解条件的影响作用。研究表明：温度,pH值,底物浓度和酶浓度影响乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度和DPPH自由基清除能力。 采用胰蛋白酶水解底物浓度40 mg／mL的乳清蛋白1h,采用响应面回归分析得到最佳水解工艺为：温度40.12℃、酶底物比6%(w/w)、pH7.02。采用二次和线性模型方程分析水解度和DPPH自由基清除率,结果表明：温度和pH值对水解度和DPPH自由基清除率具有显著影响,pH值的影响尤为显著。在最佳酶解条件下得到的乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度为22.90±0.12％。DPPH自由基,超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率的IC50分别为4.1,3.7,2.5 mg／mL,水解物的浓度为10.00 mg／mL时,还原力为0.886±0.010。乳清蛋白胰蛋白酶水解物主要由分子量小于1000 Da的短肽和氨基酸组成。与肽的抗氧化性质相关的疏水性氨基酸含量为水解物氨基酸总含量的39.01%。 采用10 kDa的超滤切向流的酶膜反应器,流速的范围为10-60 mL／min,初始水通量和截留再循环流速的范围为55-160mL／min,采用渗透总量,产物的抗氧化活性,平均膜通量和最终压力来评价酶膜反应器的稳定性。在低水通量10mLs/min时,较高的再循环流速会有高的平均膜通量,值为52%,而较低的再循环流速下,膜平均通量为29%.,当初始水通量升高至60 mL／min时,降低再循环流速,平均膜通量从13.07%降到11.33%。渗透总量随着再循环速率的提高而增加,再循环流速为160 mLs／min时,渗透总量为579 mLs,但是此时的DPPH自由基清除率为64.02±0.19%,低于130mLs/min时的65.40±0.38%。在高再循环流速下,截留组分的DPPH自由基清除率高于透过组分。不考虑初始水通量,在低再循环流速下,渗透组分的DPPH自由基清除率达到71.37±0.98%,高于高再循环流速下得到的渗透组分的DPPH自由基清除率59.64±0.71。比较最终压力,结果表明,初始水通量不变时,高再循环速率导致高的操作压力1.5 bars。 采用box-behnken因子设计优化酶膜反应的条件,该设计中包含影响酶膜反应的因素的三个水平。分别是水解初始的温度(40,45,和50℃),酶浓度(1,2,和3%)和初始水流通(15,20,和25 mLs／min)。指标包括总含量(g),蛋白转化率,透过组分的抗氧化活性,以及最终的操作压力(bar)和平均膜通量。控制底物浓度为40 mg／mL,pH 7.0,水解时间为2h。采用10 kDa(聚醚砜)的膜。涉及到六个变量的优化模型的分析研究表明：当最终压力为0.75 bars时,DPPH自由基清除率和总量达到最大,此时,Ti 50℃,,ES 2％, Ji15。DPPH自由基清除率,冻干后水解物的总量和最终的压力值分别为62.56±0.40%,14.78±1.07 g和0.91±0.01 bars。其他的结果为：渗透部分的蛋白含量为83.93±0.27%,透过部分的浓度为22.30±1.20mg/mL。平均膜通量为36.79±0.88%,水解度为18.06±0.15%。 采用二级超滤浓缩分离从酶膜反应(10 kDa)得到的酶解物。采用3 kDa和1 kDa的切向流膜分离酶解物以期减小颗粒粒径。收集冻干10-3 kDa组分(3 kDa截留组分),3-1 kDa组分(1 kDa截留组分),和1 kDa(1 kDa透过组分)。酶解物的相对分子量分布范围在130 Da～10000 Da。所有的组分都具有抗氧化活性并且有浓度依赖性。酶膜反应中得到的水解物的IC50值分别为：DPPH·,7.85；O2-·,3.25；·OH2.50mg／mL,10-3 kDa组分的IC50值分别为DPPH·,6.49；O2-·,3.60；·OH3.64mg／mL。酶膜反应得到的水解物和10-3 kDa组分富含必需氨基酸和高组分的疏水性氨基酸。二级超滤分离降低了浓缩物的必需氨基酸和疏水性氨基酸的含量。酶膜反应器和二级超滤分离联用是制备具有抗氧化活性的乳清蛋白肽的有效方法。分别研究分批反应,酶膜反应以及酶膜反应与超滤浓缩联用得到的水解物的对热,pH和贮藏稳定性。结果表明它们以冻干的状态在环境温度下都具有好的贮藏稳定性,并且在酸性条件(pH 6.3)下具有高的抗氧化活性,耐高温(63℃下30 min)。它们在中性条件下具有好的溶解性。
胰蛋白酶的制备及活力的测定
目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的大体方式。
（2）了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生必然改变后转变成有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为，最适～，在pH=3时最稳固，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳固作用。
重金属离子，有机磷化合物和反映物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发此刻一些植物的块基（如马铃薯、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，关于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
另外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的灵敏性顺序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前经常使用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方式而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一样是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提掏出来，然后再依照等电点沉淀的原理，调剂pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
酶的新进展
所谓酶（Enzyme），在希腊语里，就是存在于酵母（zyme）中的意思。
也就是，在酵母中各样各样进行着生命活动的物质被发现，然后被这样命名。
此时，“酵母”始终是活着的生命体=微生物、“酶”是活着的物质 = 制造出生命活动的不可思议的物质（按影象来说叫存活物质可能更好）。
但是酶不等于酵母：只可以说酵母是自然界所有生物体重单位体积内含酶种类及酶最丰富的！尤其是啤酒酵母！酵母是单细胞微生物，内含有许多酶，酵母具备细胞组织，而酶则是蛋白质，通常一个酵母菌里有数千种蛋白质，所以说酵母含有酶，但酶不等於酵母。
酶的发现1783年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani，1729—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。
过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。
于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。
但是什么，他不清楚。
1836年，德国科学家施旺（T.Schwann，1810—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。
解开胃的消化之谜。
1926年，美国科学家萨姆钠（J.B.Sumner，1887—1955）从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。
20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。
20世纪80年代，美国科学家切赫（T.R.Cech，1947—）和奥特曼（S.Altman，1939—）发现少数RNA也具有生物催化作用。
酶的分类根据酶所催化的反应性质的不同，将酶分成六大类：氧化还原酶类（oxidoreductase）促进底物的氧化或还原。
转移酶类（transferases）促进不同物质分子间某种化学基团的交换或转移。
水解酶类（hydrolases ）促进水解反应。
裂合酶类（lyases）催化从底物分子双键上加基团或脱基团反应，即促进一种化合物分裂为两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物。
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋源自质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测
——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程；
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树
脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋
时SDS化 )
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜）
⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
62蛋白酶
大豆肽已广泛使用于饮料、点心、及各种食品中。 推荐摄取量是每日4000mg。
1.大豆多肽的理化性质
(1) 溶解性
2） 黏度
大豆蛋白质的黏度是随着浓度的增加而增加，而大豆肽即使在很 高的浓度状态下，仍可以保持较低的黏度。
中性蛋白酶
生产菌种
枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲 霉
性质
（1）大多数微生物中性蛋白酶是金属酶，一部分酶蛋白总含有一 个锌离子，相对分子质量3500～40000，等电点在pH8～9 ，是微 生物蛋白酶中最不稳定的酶，很易自溶，即使在低温冰冻干燥的条 件下，也会造成相对分子质量的明显减少。
—CHR′—COO- + +NH3—CHR″—
C. 氨基的滴定 +NH3—CHR″— + OH-
NH2—CHR″— + H2O
蛋白质水解度测定原理
当肽键被水解裂开后，紧接着在羧基和α–氨基之间产生 质子交换作用。当蛋白质酶解过程在pH6.5以上进行时， 质子化的氨基酸将离解。
如果要保持反应体系pH不变，就必须加入碱液。
加蛋白酶 水解 氨基酸产品
氨基
• 前处理
一般采用热处理的方法，也可采取生化分离技术将 蛋白质先提取出来，再进行酶解。
2、明胶的生产
原料 动物的皮或骨 生产方法
酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。 酶法生产明胶的工艺流程如下：
原料 切割、捣碎 水洗 加酶水解 除酶 炭处理 过滤 干燥 明胶产品
溶解性、乳化性、起泡性、粘度、风味等 应用广泛
2021届北京市朝阳区高三上学期期中考试生物试题(解析版)
朝阳区2021届高三第一学期期中考试生物试卷一、选择题1. 下列物质中，不具有．．．单体的是（）A. 淀粉B. RNAC. 脂肪D. 蛋白质【答案】C【解析】【分析】1、生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子．常见的生物大分子包括：蛋白质、核酸、糖类。
2、单体与多聚体（生物小分子与生物大分子）的关系：小分子脱水缩合生成大分子，如：氨基酸脱水缩合形成蛋白质，以肽键相连；葡萄糖脱水缩合形成多糖，以糖苷键相连；核苷酸脱水缩合形成核酸，以磷酸二酯键相连。
【详解】A、淀粉的单体是葡萄糖，A正确；B、RNA的单体是核糖核苷酸，B正确；C、脂肪是由脂肪酸与甘油脱水缩合而成的，不具有单体，C错误；D、蛋白质的单体是氨基酸，D正确。
故选C。
2. 溶酶体是含有多种酸性水解酶的细胞器。
下列叙述错误．．的是（）A. 溶酶体是由脂双层构成的内、外两层膜包被的小泡B. 溶酶体中的水解酶可以分解衰老、损伤的细胞器C. 吞噬细胞吞入细菌可被溶酶体中的多种水解酶降解D. 若有大量碱性物质进入溶酶体，则可使其中的酶的活性发生改变【答案】A【解析】【分析】溶酶体内含有许多种水解酶，能够分解很多种物质以及衰老、损伤的细胞器，被比喻为细胞内的“酶仓库”“消化系统”。
【详解】A、溶酶体是由单层膜包被的小泡，A错误B、溶酶体中的水解酶可以分解衰老、损伤的细胞器，B正确；C、吞噬细胞吞入的细菌可被溶酶体内的多种水解酶分解，C正确；D、酶的活性需要适宜的条件，溶酶体中的液体pH在5左右，是溶酶体内的水解酶的最适pH，则大量碱性物质进入溶酶体可使溶酶体中酶的活性发生改变，D正确。
故选A。
3. 某种酶可用于水解机体坏死组织、变性蛋白等，能够有效预防创面、切口感染，提高引流排脓效果，该酶是（）A. 胃蛋白酶B. 肠淀粉酶C. 胰脂肪酶D. 胰蛋白酶【答案】D【解析】【分析】酶的特性：（1）高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107～1013倍。
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
化学生物学小论文-胰蛋白酶的研究及应用
化学生物学论文班级：2009级化学生物学班姓名：学号：胰蛋白酶的研究及应用摘要:以胰蛋白酶为例研究酶的结构与功能。
酶学知识来源于生产与生活实践。
我们祖先很早就会制酱和酿酒。
西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz 从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中”）。
1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。
1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。
1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。
1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。
1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。
酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。
已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。
美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。
酶所催化的反应称为酶促反应。
在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。
酶所具有的催化能力称为酶活性。
酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。
但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。
一、单纯酶和结合酶单纯酶是仅由肽链构成的酶。
如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。
RHT的最适pH和温度及其稳定性
重组人胰蛋白酶最适PH,最适温度及PH,温度稳定性
1.最适pH
配制pH为3~12的底物BAEE，分别测定重组人胰蛋白酶纯酶液的活性，结果表示为测定值占最高酶活的百分比。
缓冲液依次为NaAc-HAc(pH3~6)，Tris-HCl(pH7~8)，Gly-NaOH(pH9~11)，所有缓冲液均25℃配制。
图1.重组人胰蛋白酶的最适pH测定
2.pH稳定性
取10mg/ml重组人胰蛋白酶纯酶液，分别在pH3~11缓冲液中稀释10倍，于25℃下温育2h，以水浴前酶液的初始活性作为100%，计算残余率。
缓冲液依次为NaAc-HAc(pH3~6)，Tris-HCl(pH7~8)，Gly-NaOH(pH9~11)，所有缓冲液均25℃配制。
图2.重组人胰蛋白酶的pH稳定性
3.最适温度
将底物BAEE分别置于4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃水浴中温育30min，加入相同体积的hT2酶液测定hT2的活力，结果表示为OD253nm随时间的变化曲线。
图3.重组人胰蛋白酶的最适温度测定
4.温度稳定性研究
取1mg/ml重组人胰蛋白酶纯酶液，分别置于4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴中温育2h，每隔10min取样按常规方法测定酶活，以水浴前酶液的初始活性作为100%，计算残余率。
图4.重组人胰蛋白酶的温度稳定性。
生物化学 名词解释&问答题整理
名词解释【肽键】一个氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α-氨基发生缩合反应脱水成肽时形成的酰胺键。
【等电点（pI）】蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质解离成阴/阳离子的趋势和程度相等，呈电中性，在电场中的迁移率为零。
符号为pI。
【融解温度（Tm）】又称解链温度，DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值到达最大值的50%时的温度称为DNA的融解温度。
（最大值是完全变性，最大值的50%则是双螺旋结构失去一半）融解温度依DNA种类而定，核苷酸链越长，GC含量越高则越增高。
【增色效应】由于DNA变性引起的光吸收增加称为增色效应,也就是变性后，DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。
【必需基团】酶分子整体构象中对于酶发挥活性所必需的基团。
（教材）酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。
【活性中心】或称“活性部位”，是指必需基团（上述）在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的，能与底物发生特异性结合并将底物转化为产物的区域。
【米氏常数（Km）】在酶促反应中，某一给定底物的动力学常数（由反应中每一步反应的速度常数所合成的）。
根据米氏方程，其值是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。
符号Km 。
【糖异生】生物体将多种非糖物质（如氨基酸、丙酮酸、甘油）转变成糖（如葡萄糖，糖原）的过程，对维持血糖水平有重要意义。
在哺乳动物中，肝与肾是糖异生的主要器官。
【糖酵解】是指在氧气不足的条件下，葡萄糖或糖原分解为乳酸并产生少量能量的过程（生成少量ATP）【酮体】脂肪酸在肝脏中氧化分解的中间产物，包括乙酰乙酸、β-羟基丁酸及丙酮，这三者统称为酮体。
【脂肪动员】在病理或饥饿条件下，储存在脂肪细胞中的脂肪被脂肪酶逐步水解为游离脂肪酸（FFA）及甘油，并释放入血以供其他组织氧化利用的过程。
【呼吸链】存在于线粒体内膜上，按一定顺序排列的一系列酶与辅酶（又称电子传递链）。
酶性质——最适pH值测定
酶性质——最适pH选择姓名：俞华军班级：09级生科3班学号：200900140157 时间：2011/04/11一．实验目的1.了解掌握测定酶最适pH的实验原理和方法2.了解酶的一般特性和性质二．实验原理酶的催化活性与环境PH有密切关系，通常各种酶只在一定PH范围内才有活性，酶活性最高时的PH，称为酶的最适PH。
高于或低于此PH时酶的活性逐渐降低。
值得指出的是，不同的酶最适PH也不同，如胃蛋白酶的最适PH为1.5—2.5，胰蛋白酶的最适PH为8。
酶的最适PH不是一个特征性的物理常数，对于同一个酶，其最适PH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
如唾液淀粉酶最适PH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适PH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲液中则为5.6。
三．实验器材1. 试剂：氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、淀粉试剂（A.R）、碘液；2. 仪器：8支试管（15x15）、电磁搅拌器、水浴锅、电磁加热炉、沸水浴、玻璃棒、锥形瓶（x9）、100ml容量瓶（x2）、吸管2ml（x2）、10ml（x2）、3ml（x3）、液枪0.5ml（x2）、1.0ml（x2）、点样板、吸管（x2）、烧杯200ml（x2）、洗耳球、冰水浴；3. 材料：人口腔唾液淀粉酶。
四．实验步骤1．配制溶液A：配制0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液200ml，称取14.3256g磷酸氢二钠标准试剂于300ml锥形瓶中，加入200ml蒸馏水充分溶解；B：配制0.1mol/L的柠檬酸溶液100ml；称取2.1g柠檬酸于200ml锥形瓶中，加入100ml水充分溶解；C：配制0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液，称取0.3g氯化钠于200ml烧杯中，充分溶解后，取出约20ml到100ml烧杯中，剩余的溶液放到电磁加热炉上加热至沸，然后称取0.5g淀粉加入到有20ml左右的少量氯化钠溶液中，用玻璃棒搅成糊状后，加入到已煮沸的大量氯化钠溶液中，充分搅拌，使淀粉完全溶解；D：配制唾液淀粉酶液，漱口后在嘴里含100ml蒸馏水30s—1min后，倒于200ml烧杯中，并置于冰水浴中保藏；E：用0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液配制PH为5.4，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的缓冲液，分别置于锥形瓶中并贴上标签：表一配制不同pH缓冲液所加试剂量表2.测定保温时间（1）取一支试管,加入0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液2毫升，加入pH6.8磷酸氢二钠—柠檬酸钠缓冲液3毫升，放入37℃水浴锅中保温5min，随后加入稀释100—300倍的唾液2毫升，并开始计时。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
右旋糖苷修饰胰蛋白酶条件优化及性质研究
右旋糖苷修饰胰蛋白酶条件优化及性质研究黄继红;张龙飞;王文【摘要】由于天然酶其异源蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、酶活性较低、稳定性差等原因,严重影响胰蛋白酶的应用范围和效果.为了获取理化性质更稳定的胰蛋白酶,研究了右旋糖苷修饰胰蛋白酶的反应条件和胰蛋白酶修饰前后的酶学性质.结果表明右旋糖苷修饰胰蛋白酶的最优反应条件为:右旋糖苷与胰蛋白酶的摩尔比为1:2,修饰反应最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,最佳修饰时间为4h,胰蛋白酶保留酶活力56.1％,修饰率为49.2％.修饰后的胰蛋白酶适合温度、pH值范围变大,热稳定性和酸碱稳定性明显的提高.因而右旋糖苷修饰胰蛋白酶能够增强胰蛋白酶的热稳定性和酸碱稳定性,为胰蛋白酶的修饰提供理论参考并扩展蛋白酶的工业应用价值.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2015(044)004【总页数】5页(P1-5)【关键词】胰蛋白酶;右旋糖苷;化学修饰;酶学性质【作者】黄继红;张龙飞;王文【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;河南省食品工业科学研究所,河南郑州450003;河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】Q814胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是丝氨酸蛋白水解酶类中的一种重要类型。
在众多蛋白质水解酶中，胰蛋白酶的应用十分广泛，需求量十分大，年消耗量就占到了酶制品市场的3%左右，被广泛应用于食品业、医药业、纺织业和现代生物技术等领域［1-2］。
但由于天然酶其异源蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、酶活性较低、稳定性差等原因，严重影响胰蛋白酶的应用范围和效果。
通过化学修饰技术可以对酶分子的结构进行改造，弥补自然酶的不足，使酶发挥出更高的催化效能，以满足工业中对酶的各种需求。
通过对酶蛋白分子主链或侧链上的基团进行改造，引入或除去某些化学基团，使酶蛋白的结构发生变化，以此改善酶的性质。
酶性质——最适pH值测定
酶性质——最适pH选择姓名：俞华军班级：09级生科3班学号：200900140157 时间：2011/04/11一．实验目的1.了解掌握测定酶最适pH的实验原理和方法2.了解酶的一般特性和性质二．实验原理酶的催化活性与环境PH有密切关系，通常各种酶只在一定PH范围内才有活性，酶活性最高时的PH，称为酶的最适PH。
高于或低于此PH时酶的活性逐渐降低。
值得指出的是，不同的酶最适PH也不同，如胃蛋白酶的最适PH为1.5—2.5，胰蛋白酶的最适PH为8。
酶的最适PH不是一个特征性的物理常数，对于同一个酶，其最适PH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
如唾液淀粉酶最适PH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适PH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲液中则为5.6。
三．实验器材1. 试剂：氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、淀粉试剂（A.R）、碘液；2. 仪器：8支试管（15x15）、电磁搅拌器、水浴锅、电磁加热炉、沸水浴、玻璃棒、锥形瓶（x9）、100ml容量瓶（x2）、吸管2ml（x2）、10ml（x2）、3ml（x3）、液枪0.5ml（x2）、1.0ml（x2）、点样板、吸管（x2）、烧杯200ml（x2）、洗耳球、冰水浴；3. 材料：人口腔唾液淀粉酶。
四．实验步骤1．配制溶液A：配制0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液200ml，称取14.3256g磷酸氢二钠标准试剂于300ml锥形瓶中，加入200ml蒸馏水充分溶解；B：配制0.1mol/L的柠檬酸溶液100ml；称取2.1g柠檬酸于200ml锥形瓶中，加入100ml水充分溶解；C：配制0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液，称取0.3g氯化钠于200ml烧杯中，充分溶解后，取出约20ml到100ml烧杯中，剩余的溶液放到电磁加热炉上加热至沸，然后称取0.5g淀粉加入到有20ml左右的少量氯化钠溶液中，用玻璃棒搅成糊状后，加入到已煮沸的大量氯化钠溶液中，充分搅拌，使淀粉完全溶解；D：配制唾液淀粉酶液，漱口后在嘴里含100ml蒸馏水30s—1min后，倒于200ml烧杯中，并置于冰水浴中保藏；E：用0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液配制PH为5.4，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的缓冲液，分别置于锥形瓶中并贴上标签：表一配制不同pH缓冲液所加试剂量表2.测定保温时间（1）取一支试管,加入0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液2毫升，加入pH6.8磷酸氢二钠—柠檬酸钠缓冲液3毫升，放入37℃水浴锅中保温5min，随后加入稀释100—300倍的唾液2毫升，并开始计时。
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重组胰蛋白酶最适pH和pH稳定性
样品：重组胰蛋白酶（RPT），比活4500USP units/mg pro.（上海雅心生物技术有限公司），纯度如图1所示，BAEE（Sigma）.
图1.重组胰蛋白酶的纯度的SDS-PAGE鉴定
1.最适pH的研究
准备pH为3.0~12.0的底物BAEE（0.25mM），分别测定RPT纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。
缓冲液成分依次为25mM NaAc-HAc(pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
底物在25℃温浴10分钟后，开始测活。
2.pH稳定性的研究
取浓度为10mg/ml纯酶液，分别在pH3.0~12.0缓冲液中稀释10倍，在25℃下温浴2h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为100%，计算残余活性。
缓冲液依次为25mM NaAc-HAc (pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
图2.a,RPT最适pH曲线；b,RPT的pH稳定性
分别在pH3.0~12.0不同的pH条件下，测定RPT活性。
结果见上图2a，最适pH范围是7.0~11.0，而pH为9.0时测得RPT活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适pH为7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。
分析不同pH环境对RPT活性的影响，如图2b所示，RPT在pH3.0NaAc-HAc缓冲液里最为稳定。
随着pH的升高，RPT酶活的损失程度也随之提高。
在测定RPT最适pH值时发现，pH≤5.0底物条件下，RPT蛋白几乎无活性，如图2a所示。
而图1b所示，在pH≤5.0的缓冲液中，2小时后依然保持较高的活性。
说明在pH≤5.0，RPT稳定，自降解的速率大大降低，酶分子处于相对稳定的状态。
此时把酶液转入到pH7.6的测活体系中，此时酶分子的构象瞬间发生变化，重新暴露出活性位点，于是又恢复了活性。
此外，RPT对碱性环境有一定时间的耐受性，在pH<9.0环境中，2小时后依然有80%以上的酶活残余，从这一点讲，RPT扩大了胰酶的应用pH范围，有很大的意义。
但是pH>10.0环境中，活性损失非常快。