实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法.doc

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一、实验目的

学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。

二、实验原理

抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑

制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对

数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出

结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方

式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。

三、实验材料

供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。

实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。

四、实验方法

采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般

为外径 8 mm，内径 6 mm，高 10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。

1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7 个浓度。灭菌蒸馏水为对照。

2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL 灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动 5 min ，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15× 20 倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野

80-100 个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。

3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中，

水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50 ℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取 5 mL 带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在

底层上。

4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径 6.0mm、高 10mm），每皿内按合适的间隔放置 6 个不锈钢小管，其中 1 个小管为对照，其余 5 管为 5 种不同浓度的药液（药液加至在管口形成

凸面），在适合的温度下培养。

6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价

杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。

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