结构生物学的主要技术手段概述

结构生物学的主要技术手段概述

XXX

（XXXXX大学生命科学与技术学院，XXX省XXX市100000）

摘要：作为以极其复杂的生命系统为研究对象的实验科学，结构生物学每一次飞跃性的发展都离不开实验技术和手段的突破。而现今结构生物学研究的主要三大方法为：x射线晶体衍射法、核磁共振波谱法和冷冻电镜法。本文通过查阅相关资料对这三种方法的原理和发展过程进行了概述，并将三者的优缺点进行对比，且进一步讨论了三者的真实性问题。

关键词：结构生物学x射线晶体衍射法核磁共振波谱法冷冻电镜法

根据定义，结构生物学一门是以生物大分子三维结构（Tertiary structure）（包括构架和形态）的确定作为手段，研究生物大分子的结构功能关系，探讨生物大分子在生命活动过程中的作用机制和原理的学科。结构生物学是一门分子生物学、生物化学和生物物理学的交叉分支1。由于结构生物学能够从分子和原子水平上解释生物大分子的构象和相互作用的方式，而所有的生命活动都是通过各种生物大分子的相互作用来实现；因此，对于生物学家们来说，这是一个非常有吸引力的领域，对于人们更加深刻地认识生命过程的机制十分有力，因而如今已成为生命科学的前沿和带头学科。

然而正如几乎所有的生物学分支一样，作为以极其复杂的生命系统为研究对象的实验科学，结构生物学每一次飞跃性的发展都离不开实验技术和手段的突破。作为一门交叉学科，物理学、化学和分子生物学的进步也都推动着结构生物学的发展。而通常来说，解析所研究的生物大分子的结构是结构生物学研究的基础和根本，因而没有哪一个学科能像它一样，如此深刻又紧密地受到生物大分子结构解析相关技术的直接牵制与影响。没有这些技术，就没有结构生物学。

1.x射线晶体学

1895年德国物理学家伦琴发现X 射线；1912 年，由劳厄为首的物理学家们发现X射线可以被矿物晶体所衍射。之后的一百年里，在科学家们的努力下，X 射线衍射方法成功地应用于测定无机和有机物晶体的原子结构。晶体学由此极大地推动了结构化学、固体物理、材料科学(包括金属及半导体材料等)、结构生物学、药物研发等重要现代科学领域的快速发展2。

由于所有的原子都含有电子，并且X射线的波长范围为0.001－10纳米，其波长与成键原子之间的距离（约数十纳米）相当，因此我们可以利用电子对X 射线的散射作用，获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得关于原子位置和化学键的信息，即晶体结构。X射线可用于研究各类分子的结构，但是，到目前为止还不能用X射线对单个的分子成像，因为没有X射线透镜可以聚焦X 射线，而且X射线对单个分子的衍射能力非常弱，无法被探测。而晶体（一般为单晶）中含有数量巨大的方位相同的分子，X射线对这些分子的衍射叠加在一起就能够产生足以被探测的信号。因此，X射线晶体学可以对各类晶体结构进行研究。基本流程：获得晶体——衍射数据收集——数据分析——晶体结构解析——

建立和改进分子模型3。

2.核磁共振波谱法（NMR）

具有核磁性质的原子核(或称磁性核或自旋核)，在高强磁场的作用下，吸收射频辐射，引起核自旋能级的跃迁所产生的波谱，叫核磁共振波谱。利用核磁共振波谱进行分析的方法，叫做核磁共振波谱法（NMR）。简单来说，由于所处的化学环境不同，原子发生能级跃迁时所产生的波谱也不一样。因此我们在知道了一维结构的基础上，能够根据从中得到的诸如耦合信息和距离信息来解析蛋白质的空间结构。

1984 年，Wuthrich 等建立了磁共振解析蛋白质结构的草案。基本程序如下：( 1 ) 蛋白质水溶液的制备。蛋白质浓度在1 mmol/L 左右，并且保持均一和稳定。(2)用磁共振谱仪采集蛋白质样品的两维氢谱。(3)按顺序归属每个氢原子的化学位移数值。(4)收集NOE 距离约束的数据。(5)通过距离几何来计算蛋白质的三维结构。(6)通过能量最低化来优化蛋白质结构4。

3.冷冻电镜

透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)可以观测到分子水平的生物样品。TEM 图片代表所观测的样品在不同朝向上的投影，这些投影可以通过特定的算法对样品进行三维重建。但是早期由于生物样品本身所具有的特殊性，限制了冷冻电镜技术的发展：第一，生物样品中含水量较高，而透射电镜要求样品处于高真空的状态下；第二，高能量的电子会对样品造成损坏；第三，生物样品主要组成是碳、氢、氧等轻元素，对电子的反射及散射与水背景相比效果相近，获得的电镜图像衬度反差很小。因此，早期电镜三维重建技术的发展主要集中在解决这些基本问题上。1974 年Ken Taylor 和Robert Glaeser 发现冷冻样品可以保持蛋白质的高分辨信息。这个工作标志着冷冻电镜应用于生物物理学领域的开始。随后，Dubochet 等人发展了一套切实可行的玻璃态样品的冷冻方法。自2013年以来，冷冻电镜取得了革命性的进步，其中最主要的原因之一是电子直接探测器(direct electron-detector device，DDD)的发展5。DDD可以直接探测电子信号，而不像电荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)需要利用光电效应记录数字信号，从而大大提高了信号的转换效率，提高了信噪比。

4.对比与优缺点

1)有效性

与其他结构解析方法相比，x射线晶体衍射分辨率高，且适用于各种大小的蛋白质分子。用于X射线晶体学研究的晶体通常边长小于一个毫米。

而与之互补的核磁共振波谱学技术，不需要其研究对象形成晶体，能够直接检测溶液中的蛋白质结构状态，也具有独特的优势。我们知道，蛋白质三维空间构象不是静止的，而是在不同的构象之间进行转换，蛋白质的动态特征往往与生物学功能联系非常紧密。而NMR技术则是目前惟一能够提供高分辨率动态信息的实验手段。不过，该方法仅适用于分子量较小的蛋白质、核糖核酸(RNA)或者它们的结构域，无法解决复杂蛋白质和蛋白复合体的结构问题。

冷冻电镜近年来变得十分火热，该方法不需要蛋白质分子形成晶体结构并且仅需要相对较少量的生物样品，通过快速冷冻可以获得生物大分子的天然状态。近年来，硬件和软件的发展使得单颗粒冷冻电镜可以得到近原子分辨率的生物大